Определение в продуктах животноводства микроскопическихгрибов и их метаболитов – микотоксинов

Видео: Токсины. Какие заболевания могут вызвать микотоксины. Доктор, диетолог, Борис Скачко блогер

Цель занятия: Ознакомиться с распространением микотоксинов и их действием на организмы, изучить методы исследования микроскопических грибков и остаточных количеств микотоксинов в продуктах животноводства



Задачи:

1. Изучить распространение и опасность воздействия микотоксинов на живой организм

2. Ознакомиться с микологическими и микотоксикологическими методами исследований

3. Провести посев исследуемых образцов продуктов в специализированные среды для выявления микроскопических грибков

4. Определить концентрацию микотоксинов в исследуемых продуктах



Объекты исследования. Пробы мяса, молока, сыра, оре-хов.

Оборудование и реактивы. Агар Чапека, Сабуро- чашки Петри- пробирки- спиртовка- ножницы- пинцет, пастеровские пипетки- препаровальные иглы- предметные стекла- штамм грибка Aspergillus flavus- микроскоп- набор ТСХ- стандарты микотоксинов- термостат- белые мыши, крысы, кролики, куры, утята- рыбки Гуппи- хлороформ- уксусный ангидрит- серная, соляная кислоты.



Краткая характеристика микроскопических грибов

и их метаболитов

Из природных экотоксинов – загрязнителей сельскохозяйственного сырья и продуктов питания наибольшую опасность для здоровья населения и животных представляют микроскопические грибы и их токсины.

Грибы – это хемоорганотрофные микроорганизмы с эукариотической клеточной организацией, лишенные фотосинтетических пигментов. Грибы относят к классу Fungi (лат.) или Mycota (греч.), включающему в себя около 120000 видов. Они имеют ряд свойств присущих животным и растительным организмам. Грибы относятся к эукариотам, лишены хлорофилла и имеют включения хитина в клеточной оболочке.

Одними из наиболее благоприятных субстратов для развития раз-личных видов микроскопических грибов, являются корма растительного происхождения. Грибы в процессе своей жизнедеятельности выделяют различные метаболиты – микотоксины, которые вместе с кормом попадая в организм животного, снижают его резистентность, способствуют развитию инфекционных и незаразных болезней, снижают продуктивные качества животных, в больших количествах вызывают серьезные повреждения организма вплоть до гибели. Микотоксины составляют группу химических соединений, отличающихся высокой токсичностью, мутагенными, тератогенными, канцерогенными и иммуносупрессивными свойствами.

В настоящее время известно более 250 видов микроскопических грибов, продуцирующих по разным данным около 400 микотоксинов и оно, вероятно, будет возрастать за счет установления этиологии но-вых микотоксикозов. Наибольшую опасность представляют токсины грибов рода Aspergillus, Fusarium, Penicillium. К числу наиболее опасных микотоксинов относят: афлатоксины, охратоксины, зеараленон, трихотеценовые микотоксины, цитринин, патулин, треморгенные микотоксины, эрготоксины. Все они отличаются высокой стабильностью и сохраняют свою биологическую активность в контаминированном субстрате в течение длительного времени.

Афлатоксины – одни из сильнейших канцерогенов биологического происхождения с ярко выраженной гепатотропностью. В силу особой биологической активности и широкой распространенности особую опасность представляет афлатоксин В1.

Афлатоксины обладают способностью сильно флюоресцировать при воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения, что лежит в основе практически всех физико-химических методов их обна-ружения и количественного определения. Следует обратить внимание на то, что афлатоксины практически не разрушаются в процессе обычной технологической и кулинарной обработки загрязненных пищевых продуктов.

Главным послеубойным диагностическим признаком афлатоксикоза обычно является поражение печени, развивающиеся в различной степени и характеризующееся инфильтрацией, дегенерацией, кариолизисом и пролиферацией мезенхимы. Пролиферация часто приводит к образованию опухоли на поверхности печени. Изменения типа карциномы и саркомы в дальнейшем могут переходить в рак. Токсины аспергиллов связывают ДНК и, таким образом, тормозят образование РНК и белка, поэтому некоторые авторы начали изучать его действие на иммунитет и резистентность. С этого времени установлено, что токсины, даже в са-мой низкой концентрации, добавленные в корм птице, понижают рези-стентность последних к инфекциям.

Канцерогенная активность афлатоксинов отличается от действия других гепатоканцерогенных веществ некоторыми особенностями: возможностью развития опухолевого процесса не только при длительном влиянии малых доз токсина, но и при однократном введении большой дозы- развитием опухоли печени часто без предшествующего цирроза- развитием на фоне длительно сохраняющейся биллиарной пролиферации гепатоцеллюлярного рака, а не аденокарцином.

Мутагенное действие афлатоксинов изучено на различных организмах и типах растительных и животных клеток. Как афлатоксин В1, так и смесь афлатоксинов индуцируют хромосомные аберрации (главным образом хроматидные разрывы и транслокации) в растительных клетках, культуре клеток лейкоцитов человека, клеток почки кенгуровой крысы и китайского хомячка, в клетках костного мозга мышей, хомячков и обезьян.

Данные о тератогенных свойствах афлатоксинов малочисленны. В экспериментах тератогенное действие афлатоксина В1 было продемон-стрировано на хомячках, крысах, мышах и на цыплятах.

Результаты изучения влияния афлатоксинов на иммунный ответ у различных животных и птиц показали, что они являются сильными иммунодепрессантами и подавляют как клеточный и гуморальный иммунитет, так и факторы неспецифической защиты организма. Результатом снижения функциональной активности иммунной системы животных под действием афлатоксинов является уменьшение их резистентности к инфекционным заболеваниям. Максимально допустимая концентрация афлатоксинов в пищевых продуктах – 0,005 мг/кг (Е.М. Кожевников, Б.С. Майканов).



Методы выделения грибов

В качестве твердых питательных сред наиболее широко применя-ются сусло-агар, агар Чапека, картофельный агар с добавлением различных антибиотиков для подавления роста бактерий.

Культивирование проводят в термостате при температуре 24-26 и 37 °С в течение 3-12 дней в зависимости от вида развивающихся гри-бов.

При выделении грибов из пораженного материала пользуются разными методиками, в зависимости от того, какую преследуют цель: выделение поверхностной микофлоры или глубинной. С целью определения общей микобиоты обычно пользуются следующей методикой: отдельные зерна или мелко нарезанные кусочки исследуемых образцов без предварительной обработки раскладывают на поверхности питательной среды и наблюдают за ростом колоний грибов.

При выявлении поверхностной микофлоры делают смыв стериль-ной водой и высевают на питательные среды. Для смыва большего ко-личества спор пробы рекомендуется хорошо встряхивать.

Более сложной является методика выделения глубинной микофло-ры, при которой обязательна предварительная дезинфекция пробы с целью подавления грибов, находящихся на поверхности исследуемого материала.



Определение концентрации афлатоксинов в продуктах животноводства методом тонкослойной хроматографии

Определение концентрации афлатоксинов в корме, молоке, внут-ренних органах и мышечной ткани проводят методом двумерной тонкослойной хроматографии с применением пластинок «Силуфол» согласно «Методическим рекомендациям по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах».

Метод основан на экстракции токсинов из кормов водным ацетоном (ГОСТ 2603-71 Ацетон) при шуттелировании, очистке первоначального экстракта от сопутствующих примесей гексаном (ТУ 6-09-3375-73) с дальнейшей переэкстракцией токсинов в хлороформ (ГОСТ 3160-51 Хлороформ медицинский) или бензол (ГОСТ 5955-75 Бензол) и очисткой на хроматографической колонке с силикагелем и окисью алюминия. Идентификация и количественное определение основано на методе хроматографии экстракта в тонком слое с использованием пластинок «Силуфол», с последующим просмотром в ультрафиолетовом свете с длиной волны 365 н. и сравнении со стан-дартами афлатоксинов.



Контроль токсичности исследуемого материала

Исследование проб на наличие микотоксинов осуществляют с по-мощью различных методов, которые можно подразделить на три ос-новные группы: биологические, химические и физико-химические.

Биологические методы. С помощью этого метода проводят био-пробу на животных, у которых был зафиксирован токсикоз. При осу-ществлении этой работы важное значение имеют рацион кормления и пробы корма, отбираемые для опыта.

Определение токсичности кормов на лабораторных живот-ных. Для этих целей используют белых мышей, крыс, морских свинок, кроликов, цыплят, утят, голубей, щенков, котят и др. Суточную норму обычных кормов заменяют исследуемым кормом. Для его лучшей поедаемости целесообразно животных предварительно выдержать на голодной диете. Во время опыта водопой не ограничивают. Ежедневно регистрируют количество съеденного корма и состояние подопытных животных. В зависимости от степени токсичности корма проявление клинических признаков микотоксикоза наступает в различные сроки. Характерные клинические признаки: угнетение дрожь, парезы, параличи, потеря блеска шерсти. Корма пораженные токсигенными грибами, вызывают гибель животных в сроки от 1 до 30 дней с признаками поражения центральной нервной системы. У птиц отмечают цианоз гребня и сережек, понос, сонливость.

Помимо скармливания исследуемых проб животным, можно вводить их непосредственно в желудок.

Введение в желудок. Из исследуемой навески приготавливают водную болтушку и вводят мышам натощак в желудок в течение 3 дней в количестве 0,5 мл. В качестве зонда может служить надетая на шприц, тупая, слегка согнутая игла. Токсичность корма определяют по времени гибели мышей и количеству введенной вытяжки или экстракта. Для исследования кормов, пораженных грибом A. flavus, экстракт из образца вводят в железистый желудок однодневных утят: в 1-й день – 0,5 мл, во 2-й – 0,75, в 3-й – 1,25, в 4-й день – 1,5 мл. Наблюдение за утятами ведут в течение 7 дней, затем их убивают и исследуют печень. Наличие жировой дистрофии, развитие пролиферативных процессов в желчных протоках, множественные геморрагии свидетельствуют о наличии в исследуемых кормах афлатоксинов.

Постановка кожной пробы на кролике. Эта методика является наиболее распространенной ввиду сравнительной ее несложности. Кожная проба дает возможность не только ответить на вопрос о ток-сичности корма, но и по характеру поражения кожи составить пред-ставление о степени токсичности грибов.

В качестве подопытных животных используют кроликов с непиг-ментированной кожей, живой массой 2-3 кг, хорошей упитанности. У животных осторожно, не допуская скарификации и травматизации, выстригают на боку шерсть. На участок оголенной кожи диаметром 3 см двукратно с интервалом в 24 ч наносят полученный экстракт, втирая его стеклянной палочкой во всю выстриженную поверхность кожи. Для предупреждения слизывания экстракта, который вызывает раздражение кожи, на шею кролика надевают деревянный воротник. Учет реакции проводят ежедневно в течение 3-7 дней. Степень токсичности дифференцируют по глубине и характеру воспалительной реакции:

I степень – покраснение, повышенная чувствительность кожи, ше-лушение-

II степень – покраснение, болезненность, незначительное утолще-ние кожи, мелкие одиночные с просяное зерно или меньше желтоватые пузырьки, шелушение-

III степень – покраснение, сильное утолщение, болезненность, складчатость кожи, на всей поверхности желтые очаги, поверхностный некроз, иногда язвы, сплошной струп-

IV степень – покраснение, сильный отек, выступающим в виде массивного вала на нижней границе- некроз, захватывающий подкожную клетчатку, нередко образование долго не заживающих язв. Струп толстый и сплошной.

Глазная проба. Измельченный корм заливают водой в соотношении 1:10. После 24-часового экстрагирования фильтруют через марлю, а затем через бумажный фильтр. Контролем служит водный экстракт. Подопытному кролику в конъюнктивальный мешок одного глаза вводят по 5 капель исследуемой вытяжки с интервалом 5 мин в течение 1 ч. Во второй глаз инъецируют контрольный экстракт. Через 1 ч после введения токсичного экстракта отмечают расширение зрачка на 3-4 мм, которое сохраняется в течение 5-б ч. Контрольная вытяжка вызывает кратковременное расширение зрачка на 1-2 мм. Методика применяется для определения токсичности грибов рода Fusarium и микромицета Ph. chartarum. Введение споридесмина вызывает поражение роговицы и косоглазие.

Проба на бородках кур. Измельченный корм заливают эфиром или спирт-эфиром и экстрагируют в течение 24 ч, затем фильтруют и испаряют разбавитель.

Эфирные экстракты вводят в одну из бородок курицы в дозе 0,1-0,2 мл, вторая бородка служит контролем. Степень токсичности определяют по наличию воспалительного процесса – отеку бородки. Толщина бородки может достигать 5-8 мм. У контрольной птицы толщина бородки не превышает 4 мм. Реакция наиболее выражена через 20-24 ч после введения экстрактов.

Токсико-биологическую оценку исследуемых проб проводят на аквариумных рыбках гуппи согласно методике «Биологическая оценка токсичности продуктов». Принцип методики основан на извлечении из анализируемых проб молока фракции афлатоксинов ацетоном с очисткой от жировых веществ гексаном и переэкстракцией в хлороформ. Высушенные досуха экстракты проб молока растворили по отдельности в 5 мл ацетона и перенесли в химические стаканы емкостью 1000 мл с 500 мл аквариумной воды с комнатной температурой (20 °С). В каждый химический стакан помещают по 5 взрослых гуппи, за которыми ведут наблюдение, отмечая гибель через 24 часа. Оценку токсичности проб молока устанавливали по схеме, отраженной в таблице 2.



Таблица 2 – Оценка степени токсичности

Кроме вышеперечисленных биологических методов ставят пробу на эритроцитах крыс, на сердце лягушки, на простейших и на яйцах моллюсков.

Микробиологические методы. Микробиологические методы об-наружения микотоксинов основаны на принципе ингибирования роста бактериальных и дрожжевых тест-культур под действием испытуемых экстрактов. Для каждого микотоксина подобраны чувствительные микроорганизмы. Для фузариотоксинов, Т-2-токсина, зеараленона используют культуру дрожжей Saccharomyces fragilis, для фумигатоксинов – Staphylococcus aureus, для дендродохиотоксинов – суточную культуру Saccharomyces vini, для патулина – Bacillus subtilis. С целью проведения исследований применяют следующие методы: Метод бумажных диско, метод цилиндров и метод лунок.

Химические методы. Методы основаны на свойстве токсинов грибов, содержащихся в эфирных экстрактах, при соединении с химическими веществами изменять их цвет.

Реакция Либермана-Бурхарда. Экстракт кормов или грибов стахиботриотоксикоза и фузариотоксикоза в количестве 2-3 мл выпаривают в осадок и вновь растворяют в хлороформе. К раствору добавляют несколько капель уксусного ангидрида. На полученный раствор осторожно по стенке наслаивают концентрированную серную кислоту. При наличии токсических веществ на границе раздела жидкостей появляется кольцо зеленого цвета, которое затем становится фиолетовым, а позже бурым.

Реакция с концентрированной соляной кислотой. К 1 мл экстракта добавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. При наличии токсических веществ грибов рода Fusarium раствор окрашивается в красный или вишневый цвет.

Реакция с концентрированным раствором аммиака. К 1 мл экс-тракта токсина в серном эфире добавляют 5-7 мл 96% этанола, осторожно подогревают и добавляют 5-7 мл 25% водного раствора аммиака. При кипячении в течение 5-10 мин при наличии микотоксинов появляется интенсивная черно-фиолетовая окраска, затем выпадает осадок черного цвета.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!