Химико-токсикологические исследования мяса,мясопродуктов, молока и меда
Цель занятия: Освоить методики химико-токсикологического исследования токсичных элементов, остаточных количеств пестицидов в продуктах животноводстваЗадачи:
1. Изучить методы диагностики отравлений
2. Определить содержание пестицидов агар-дифузным мето-дом
3. Определить наличие хлорорганических пестицидов (ХОП) хро-матографией в тонком слое (ТСХ)
4. Определить наличие фосфорорганических пестицидов (ФОП) энзимо-хроматографией
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани разных видов убойных животных и птицы- субпродукты I и II категорий, мясные продукты различных ассортиментных групп- пищевые животные жиры.
Методические указания. Бурное развитие химической промыш-ленности, внедрение химической технологии во многие отрасли народного хозяйства и сферу быта создают загрязнение среды обитания и серьезную угрозу здоровью населения. В последние десятилетия отмечается чрезвычайно широкое использование разнообразных химических средств и препаратов в сельскохозяйственном производстве, что связано с возможностью попадания их остатков в корма, и, в конечном счете, в продукты питания животного и растительного происхождения. При обработках скота и птицы пестициды обнаруживают в молоке, мясе, яйцах и жире животных. Содержание остаточных количеств химических веществ в продуктах питания зависит от их физико-химических свойств, устойчивости к воздействию биологических и абиотических факторов, способов и кратности обработок, метеорологических условий и сроков ожидания с момента применения. С целью охраны здоровья человека необходим действенный контроль по выявлению остаточных количеств токсических компонентов в продуктах животноводства широким кругом лабораторий.
Лабораторная работа по определению токсикантов является ком-плексной и включает в себя несколько этапов, каждый из которых может использоваться как самостоятельно, так и в комплексе. Тяжелые металлы и мышьяк в биологических объектах прочно связаны с белками. Для их определения необходимо разрушить эти комплексы (альбуминаты). Цель достигается сухой, мокрой минерализацией или кислотной экстракцией (в случае анализа жировых продуктов) исследуемого материала.
Способ сухой минерализации основан на полном разложении органических веществ путем сжигания образца сырья или продукта в электропечи при контролируемом температурном режиме. Этот способ рекомендуется использовать при подготовке проб всех видов мясного сырья и продуктов, кроме жиров, для определения содержания свинца, кадмия, меди, цинка методом атомно-абсорбционной спектрометрии.
Способ мокрой (кислотной) минерализации основан на полном разрушении органических веществ пробы продукта при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением хлорной кислоты или пероксида водорода и может быть использован для исследования всех видов мясного сырья и продуктов, кроме животных жиров.
Способ мокрой минерализации применяется при подготовке проб для качественных реакций обнаружения свинца и цинка, качественного и количественного определений мышьяка, определения олова в мясном сырье и продуктах, за исключением жировых, а также для определения содержания меди во всех видах продуктов, включая жиры.
Способ кислотной экстракции (неполной минерализации) основан на экстракции токсичных элементов из пробы продукта при кипячении с разбавленными растворами соляной или азотной кислоты. Способ может быть использован при подготовке проб для определения содержания в животных жирах меди колориметрическим методом, а также других токсичных элементов методами атомно-абсорбционной спектроскопии и вольтамперометрии.
Рекомендации по выбору конкретных методов определения токсичных элементов в мясе и мясных продуктах и соответствующих способов подготовки проб приведены в таблице 3.
При высоком содержании токсичных металлов и мышьяка в мясе и продуктах убоя животных их присутствие можно обнаружить при проведении с минерализатом несложных качественных цветных или других специфических реакций.
Методы качественного обнаружения свинца в минерализате осно-ваны на его растворении в ацетате аммония с последующей постановкой цветной реакции с дитизоном или микрокристаллоскопических реакций.
Метод выявления меди основан на экстрагировании ее из мине-рализата хлороформом в виде диэтилдитиокарбамината меди, последующего вытеснения из этого соединения в водный слой ртутью, где она и обнаруживается соответствующими цветными реакциями.
Метод обнаружения цинка основан на экстракции цинка из минерализата хлороформом, связывании ионов кадмия и меди (мешающих обнаружению цинка) тиосульфатом натрия или мочевиной, образовании окрашенного соединения цинка с дитизоном - дитизоната цинка.
Метод качественного и количественного определения мышьяка (по Зангер-Блеку) основан на восстановлении мышьяка до мышьяковистого водорода AsH3, который при взаимодействии с хлоридом HgCl2 или бромидом ртути HgBr2 образует окрашенное в желтый или желтовато-коричневый цвет соединение.
Таблица 3 – Методы определения токсичных элементов в мясе и мясных
продуктах
Атомно-абсорбционная спектрометрия основана на измерении поглощения электромагнитного излучения атомным «паром» анализируемого вещества. Разность интенсивности излучения до и после прохождения через анализируемый образец измеряют фотометрически.
Полярографический метод определения токсичных элементов основан на предварительной сухой минерализации пробы продукта, получении раствора минерализата с добавлением фонового электролита, проведении анализа в электролизере, получении полярографических кривых и измерении высоты пиков. Для количественного определения металлов используют метод добавок.
Практическое значение имеют и различные колориметрические методы определения токсичных элементов.
Например, колориметрический метод определения ртути основан на деструкции анализируемой пробы мяса или мясных продуктов смесью азотной и серной кислот, осаждении ртути иодидом меди и последующем колориметрическом определении в виде тетраиодомеркурата меди путем визуального сравнения со стандартной шкалой. Минимальная определяемая масса ртути составляет 0,15 мкг в колориметрируемом объеме пробы.
Фотоколориметрические методы определения меди и мышьяка в мясе и мясных продуктах основаны на минерализации пробы и после-дующем измерении интенсивности окраски раствора соответствующего комплексного соединения: меди – с диэтилди-тиокарбаматом натрия (желтого цвета), мышьяка – с диэтилди-тиокарбаматом серебра в хлороформе.
Необходим строгий контроль остаточных количеств ХОП, ФОП и их метаболитов в продуктах животноводства, в частности в мясе и мясных продуктах, на соответствие санитарно-гигиеническим нормам. В соответствии с требованиями безопасный уровень содержания хлорорганических пестицидов (ДДТ и его метаболитов, гексахлорциклогексана) в продукте должен составлять не более 0,1 мг/кг продукта, а предельно допустимая концентрация большинства хлорорганических, фосфорорганических и триазиновых пестицидов – 0,01-1 мг/кг продукта.
Метод ТСХ для определения остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах считается перспективным с точки зрения экспрессности и избирательности. Его широко используют для контроля за остаточным содержанием пестицидов в пищевом сырье и готовой продукции.
Метод основан на экстрагировании препаратов из исследуемого материала органическими растворителями, очистке экстрактов и последующем хроматографировании в тонком слое сорбентов. Подвижным растворителем служит гексан или гексан в смеси с ацетоном. Места локализации пестицидов обнаруживают после опрыскивания пластинок раствором аммиаката серебра с последующим ультрафиолетовым облучением пластинок «Силуфол», содержащих о-толуидин. Количественное определение проводят визуальным сравнением или измерением площадей пятен пробы и стандартных растворов. Этим методом можно определить ДДТ, гексахлоран, альдрин, кельтан, гептахлор, метоксихлор, эфир-сульфонат и другие препараты. Наименьшее содержание пестицида, выявляемое в мясе, органах и жире, 0,02 мг/кг.
Определение ФОП энзимохроматографическим методом (метод М.В. Письменной) основано на экстрагировании ФОП из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстракта охлажденным ацетоном и определении препарата на пластинке методом хроматографии в тонком слое с ферментным проявлением без активации или после активации. Фосфорные (ДДВФ, дибром и др.) и тиофосфорные эфиры (рицид, циодрин и др.) определяют без активации, а тиофосфорнокислые эфиры (метафос, метилнитрофос, пиразофос и др.), дитиофосфаты (карбофос, фталофос, фозалон, рогор и др.) и эфиры фосфорной кислоты (хлорофос) необходимо предварительно активировать. Препараты, угнетающие холинэстеразу, проявляются в виде белых пятен на голубом фоне.
Диагностика отравлений (постмортальная)
Патологогистологические изменения. У отравленных животных они характеризуются гистолимфоцитарной инфильтрацией, деструктивно-дистрофическими некробиотическими и некротическими явлениями в печени, почках и других внутренних органах и тканях. Экспериментальные данные А.В. Акулова, С.М. Евдокимова, В.А. Макарова и других, полученные при отравлении животных карбаматными пестицидами в переносимых дозах показали, что в печени при гистологическом исследовании наблюдают застойные явления, кровоизлияния и инфильтрацию вокруг портальных сосудов. На отдельных участках органа отмечали декомплексацию (деструктивный некроз) печеночных балок по периферии долек, выраженную гистолимфоцитарную инфильтрацию и раздражение Купферовских клеток. Почки были кровенаполненными, просветы нефронов расширены, наблюдалось увеличение полости Боуменовой капсулы, и на фоне лимфоцитарной инфильтрации – атрезия мальпигиевых клубочков и даже их выпадение. Для легких типичны перибронхиальная инфильтрация гистолимфоцитарными элементами до образования солитарных фолликулов, выраженный ателектаз и в местах ателектаза – умеренная гистолимфоцитарная инфильтрация паренхимы органа. Селезенка наполнена красной пульпой, уменьшены или совсем не просматриваются центры мальпигиевых телец. Возможны изменения и в миокарде, которые характеризуются разъединением групп мышечных волокон, их гистолимфоцитарной инфильтрацией и на отдельных участках - потерей поперечной исчерченности. В меньшей мере патогистологические изменения проявляются в мышечной ткани. Тем не менее, в случаях вынужденного убоя животных с тяжело протекающими клиническими симптомами интоксикации в мышечной ткани возможны не-значительный ее отек, сглаживание межмышечных пространств, гисто-лимфоцитарная инфильтрация участков соединительной ткани, а на поперечном срезе бывают заметны различия тинкториальных свойств (различная способность мышц к окрашиванию).
Лабораторные исследования пестицидов
Необходимы для подтверждения диагноза на отравление, определения состояния животного перед убоем, а также установления возможных остаточных количеств ядовитого или токсического вещества в мясе и степень его бактериального обсеменения.
Для исследования на содержание остатков ядовитого или токсиче-ского вещества в ветеринарную лабораторию направляют пробы мы-шечной, жировой ткани и печени массой по 200 г. Если при вынужденном убое животного пробы берут на месте убоя, то необходимо еще взять содержимое преджелудков или желудка.
Для бактериологического и биохимического исследований в лабораторию направляют часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8x6x6 см, лимфатические узлы (поверхностный шейный, наружный подвздошный) с окружающей их соединительной и жировой тканью, а также долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Плотные пробы завертывают в вощеную или пергаментную бумагу, наклеивают этикетки, нумеруют, завертывают в общий пакет, перевязывают шпагатом, пломбируют или опечатывают сургучной печатью. Содержимое желудков или преджелудков помещают в чистые сухие стеклянные банки. Упаковка должна гарантировать целостность доставляемого в лабораторию материала. Пересылать пробы в лабораторию нужно как можно быстрее, так как время от взятия пробы до начала анализа может повлиять на результат исследования.
На отправляемый материал составляют сопроводительный доку-мент, в котором указывают вид животного, время взятия пробы, пере-чень образцов с указанием их массы, характера тары и упаковки, причины направления проб в лабораторию. Необходимо отметить наблюдаемую клиническую картину отравления, а также подробно описать патологоанатомические изменения, обнаруженные в органах и тканях. В случаях убоя животных после их обработки пестицидами следует назвать применяемый препарат, кратность его применения и дату последней обработки скота в хозяйстве. В сопроводительном документе указывают, на какие ядовитые вещества нужно проводить анализ. Сопроводительный документ подписывает ветеринарный врач или другое должностное лицо, направляющее пробы на исследование.
Химико-токсикологические исследования на ядовитые вещества определяются данными сопроводительного документа и результатом патологоанатомического исследования присланного материала. Если в сопроводительном документе не указано, на какие ядовитые вещества проводить исследование, то хозяйство запрашивают о том, какие ядохимикаты применялись в последнее время в животноводстве и растениеводстве или какие удобрения могли послужить причиной отравления животных. Следует также выяснить состав рациона и качество кормов. В зависимости от полученных сведений в каждом отдельном случае составляется план проведения токсикологического анализа. Если причина отравлений остается неизвестной, то в лаборатории сначала исследуют содержимое желудка последовательно на соли тяжелых металлов, пестициды, алкалоиды, микотоксины групповыми методами в целях постановки диагноза на отравление, а затем - мышечную и жировую ткани и печень на содержание ядов. Исследования проводят с использованием официальных методов, утвержденных Минздравом. В ответе лаборатории должен быть указан метод, которым выявлены остаточные количества яда, и даны рекомендации по использованию продуктов убоя животных.
Биохимическое исследование включает определение величины рН мяса и постановку реакции на пероксидазу- пробы мяса крупного рогатого скота исследуют дополнительно реакцией с нейтральным формалином (формольная реакция). Биохимическое исследование проб не следует проводить в день убоя животного, так как при незавершившемся процессе созревания мяса могут быть, получены необъективные показатели. Рекомендуется пробы мяса, предназначенные для биохимического исследования, освобождать от упаковки и при низких плюсовых температурах (в бытовом холодильнике) оставлять до следующего рабочего дня.
Для определения ФОП в биологических объектах применяют раз-ные аналитические методы: спектрофотометрию, полярографию, кри-сталлоскопию, все виды хроматографии от колоночной до газожидкостной, а также энзимный и биологический. Из перечисленных наиболее доступными для широкого круга исследователей являются ферментные и хроматографические методы.
Агар-диффузный метод (разработан А.А. Непоклоновым и В.К. Метелицей). Приготовление среды-агара. 16 г. агар-агара перемешивают в 800 мл горячей дистиллированной воды до полного растворения, фильтруют на марлевый фильтр, охлаждают до 50°С, рН полученной среды колеблется от 5,6 до 7,7. Для стабилизации среды в нее добавляют 10% раствор едкого натра: при рН 5,6-5,9 – 3 мл, при рН 6,3-6,7 – 0,5 мл, при рН 7,5-7,7 – 0,3 мл. После перемешивания среду выдерживают при комнатной температуре в пределах суток, затем расплавляют, доводя температуру до 50°С и добавляют 100 мг бромтимолового синего, растворенного в 2 мл 0,1 Н раствора едкого натра, и добавляют 20 мл лошадиной сыворотки, разведенной до 200 мл дистиллированной водой. рН среды доводят до 7,8-8,0 при температуре 50 °С. Среду разливают в чашки Петри по 35 мл, толщина слоя 5-6 мм.
Экстракция пестицидов. Пробу массой 20 г тщательно измельчают, добавляют 20 мл хлороформа, перемешивают, закрывают пробкой и выдерживают при комнатной температуре 2 часа. Хлороформенный экстракт отфильтровывают на бумажный фильтр в выпарительную чашку и упаривают в токе воздуха при комнатной температуре досуха. Остаток растворяют в 1 мл этанола или ацетона. ФОП, производные тио- и дитиофосфорных кислот об-ладают слабым ингибирующим действием на холинэстеразу in vitro, поэтому, окисляя бромом, их переводят в дереваты, сильные ингибиторы. При подозрении на отравление хлорофосом ДДВФ, дибромом, амидофосом, циодрином проводить акцивацию экстракта бромом не следует.
Проведение анализа. В застывшем агаре корковым сверлом диа-метром 8-10 мм просверливают лунки в центре чашки Петри, в лунки вносят по 0,1 мл экстракта. Чашки закрывают крышками и оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре или ставят на 6-8 часов в термостат при 38 °С, затем поверхность агара заливают тонким слоем 0,5% водным раствором ацетилхолина и ставят на водяную баня при 40 °С на 30 минут. Наличие в экстракте ФОП обнаруживается появлением вокруг лунки синих или сине-зеленых кругов на желтоватом фоне агара чашки. Интенсивность окраски и диаметр круга зависят от количества пестицида в пробе. Если известно, какой ФОП вызвал отравление, то проводят количественное определение, сравнивая диаметр окрашенного круга вокруг лунки исследуемой пробы с лунками со стандартными растворами ФОП. Но при этом надо учитывать, что из пробы извлекается около 50% пестицида, следовательно, полученный результат удваивают. Однако этот метод является ориентировочным и в основном позволяет дать заключение о присутствии или отсутствии ингибитора холинэстеразы в пробе. Метод неспецифичен, он выявляет всю группу ФОП. Для определения конкретного пестицида или нескольких, находящихся в пробе, необходимо дополнительно пробу исследовать другим методом с ис-пользованием газожидкостной или тонкослойной хроматографии. Так как жидкостная хроматография доступна весьма оснащенным лабораториям, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), доступный широкому кругу исследователей.
Поделиться в соцсетях:
Похожие
