Определение в продуктах животноводства гормонов

Видео: Приготовление нежнейшего карбонада.

Цель занятия: Изучить и освоить серийный анализ мясных продуктов на содержание гормональных препаратов методом ELISA с использованием стандартных наборов для иммуноферментного анализа.

Задачи:

1. Подготовить пробы.

2. Определить остаточное содержание гормональных препаратов в мясе и мясных продуктах.

Объекты исследования. Мясо и мясные продукты из говядины, свинины и птицы.

Материалы, реактивы и оборудование. Набор для иммуноферментной очистки экстрактов, концентрированный буферный раствор для промывки колонки- вспомогательный набор для определения стильбенов иммуноферментным методом (кат. NSJ 2152) на 96 определений, включающий: микроплашку на 12?8 мм разбор-ных ячеек с сенсибилизированными к стильбенам антителами- буферный раствор для промывки плашки и разбавления проб- белковый конъюгат- субстрат для окра-шивания пробы- набор стандартных растворов концентрацией стильбена от 0 до 10 нг/см3 и спектрофотометр- метилтретбутиловый или серный эфир- хлороформ- рас-твор гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3- раствор фосфорной кислоты молярной концентрацией 6 моль/дм3- раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3- раствор этанола (70 об.%)- бидистиллированная во-да.

Приготовление реактивов. Буферный раствор для промывки колонки. К одной части концентрированного раствора моющего буфера добавляют 19 частей бидистиллированной воды.

Буферный раствор для хранения колонки. К одной части концентрированного раствора буфера для хранения добавляют 4 объема бидистиллированной во-ды.

Белковый конъюгат. Концентрированный конъюгат разбавляют в 15000 раз (см. инструкцию к прибору).

Субстраты А и Б для окрашивания пробы (см. инструкцию к прибору). Перед применением субстраты смешивают в соотношении 1:1.

Методические указания. Так называемые «гормональные технологии» привлекают внимание товаропроизводителей мяса из-за известного положительного влияния некоторых гормонов на быстрый прирост массы скота (на 5-25%). Несмотря на запрет применения гормонов в Республике Казахстан, России, в ряде европейских стран и на Американском континенте гормоны используются достаточно широко. Рост импорта мяса у нас в стране делает проблему гормонального контроля весьма актуальной.

Для аналитического определения остатков гормональных препаратов используют две основные группы методов: хроматографические (тонкослойная хроматография – ТСХ- высокоэффективная жидкостная хроматография – ВЭЖХ- жидкостная хроматография с масс-спектрофотометрическим детектированием – ЖХМС- газовая хроматография с масс-спектрофотометрическим окончанием – ГХМС) и современные иммунные методы (иммуноферментный метод – ELISA и радиоиммунный метод – RIA).

Среди требований, предъявляемых к методам экспресс-мониторинга продовольствия, главное место занимают чувствитель-ность и селективность метода, а также время и стоимость анализа. Некоторые характеристики методов представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Максимальный уровень содержания гормонов в мяс-ных

продуктах, определяемый различными методами

Максимальный уровень содержания гормонов в мясных продуктах

Как видно из данных таблицы 1, метод ELISA, широко используемый в европейских странах для контроля безопасности мяса и мясопродуктов, имеет явные преимущества.

Анализ структурных особенностей сложных органических соединений показывает, что развитие метаболических процессов в живых организмах, а также развитие дальнейших процессов приводят к уменьшению концентрации, например, самого диэтилстильбэстрола и появлению родственных химических метаболитов, отличающихся от исходного вещества наличием различных органических заместителей, т. е. через определенное время в зависимости от химической устойчивости токсиканта он либо исчезнет в продукте, либо трансформируется, а токсичность вновь образовавшихся веществ со структурой, подобной исходному веществу, окажется близкой к токсичности первоначального вещества, что также опасно для человека.

Предлагаемый к изучению и освоению иммуноферментный метод обладает так называемой перекрестной чувствительностью, т.е., являясь исключительно специфичным методом применительно к какому-либо веществу, позволяет определить всю группу родственных соединений, что повышает его ценность для реальной сертификации пищевой продукции по максимально возможному числу вредных токсикантов.

Подготовка проб. Гомогенизируют 2,5 г образца мяса или мясо-продукта с 15 см3 метилтретбутилового или серного эфира, гомогенат перемешивают и отделяют центрифугированием при частоте вращения 33,3 с–1 в течение 10 мин или отстаиванием 12 см3 эфирного слоя, который испаряют в токе сжатого воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 см3 хлороформа, добавляют 2 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3, раствор перемешивают и отделяют 1 см3 водного слоя с последующим добавлением еще 1см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 к слою хлороформа и отделением 1 см3 водного экстракта. Водный экстракт нейтрализуют, добавляя к 2 см3 экстракта 200 мкдм3 раствора фосфорной кислоты молярной концентрацией 6 моль/дм3 и раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3.

Порядок проведения анализа. Весь объем нейтрализованного раствора наносят на иммуноферментную колонку после ее кондиционирования, которую для этого промывают 15 см3 предварительно разбавленного раствора моющего буфера (расход менее 3см3/мин). Экстракт пропускают через колонку самотеком, промывают колонку 5 см3 разбавленного раствора моющего буфера и 5см3 бидистиллированной воды (расход менее 5 см3/мин). Элюируют фракцию стильбенов, промывая колонку 3 см3 раствора этанола (70 об.%) Колонку окончательно промывают 10 см3 раствора этанола (70 об.%).

С помощью пипетки в лунки плашки вносят по 100 мкдм3 разбав-ленного буферного и 25 мкдм3 анализируемого растворов с иммуноферментной колонки (или стандартного образца). Затем плашку выдерживают в темноте при комнатной температуре (19-25 °С) в течение 1 ч. С помощью пипетки добавляют по 75 мкдм3 разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку плашки, выдерживают в течение 30 мин, промывают плашку 10-12 раз разбавленным буферным раствором и высушивают. Затем добавляют по 25 мкдм3 смеси субстратов А и Б в соотношении 1:1, выдерживают плашку в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин и добавляют в каждую лунку по 50 мкдм3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3. При этом наблюдают за изменением голубого окрашивания раствора в лунках плашки на желтое. Оптическую плотность растворов в лунках измеряют при длине волны на спектрофотометре 450 нм. Содержание гормонов определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Для построения графика используют стандартные растворы известной концентрации гормона, которые помещают в лунки плашки и окрашивают в аналогичных с исследуемой пробой условиях.

Экспериментальные данные оформляют в виде таблицы:

Таблица