Структурные и функциональные особенности генов в диагностике и лечении рака

Карпухин А.В.1, Бавыкин А.С.1, Н.В. Апанович1, Коротаева А.А.1, Шубин В.П.1,

Сырцев А.В.1, Поспехова Н.И.1, Логинова А.Н.1, Петерс М.В.2, Кашурников А.Ю.2, Зенит-Журавлева Е.Г.1, Гончарова Е.А.1, Грицай А.Н.,? Любченко Л.Н.2,

Матвеев В.Б.2, Тюляндин С.А2.

1Медико-генетический научный центр РАМН-

2Российский онкологический научный центр им. Блохина РАМН, Москва

Главные проблемы терапевтического лечения рака – недостаточная эффективность лекарственных средств и их значительное побочное воздействие вследствие низкой избирательности существующей химиотерапии. Низкая эффективность терапии, помимо отсутствия или малой представленности высокоэффективных средств, обусловлена также гетерогенностью раковых опухолей даже одной локализации по генотипическим нарушениям. В результате раковые опухоли одинакового типа и происхождения по-разному реагируют на лекарственную терапию. Достижения последних лет в сфере изучения генома раковой клетки открывают возможности создания средств терапии рака на принципиально новой основе. Блокируя действие некоторых генов, можно прервать развитие опухоли или вызвать гибель раковых клеток. Наиболее современный способ «выключения» генов основан на недавно обнаруженном явлении РНК-интерференции.

РНК-интерференция – природное явление, присущее в том числе и человеку. Преимущество его применения для требуемого «выключения» генов состоит в высокой избирательности и понятной природной функциональной активности.

Однако их практическое применение ограничивается рядом пока не решенных проблем. Одна из них состоит в определении генов, ингибирование которых будет наиболее эффективно для уничтожения раковых клеток при минимальных побочных эффектах. Мощным инструментом выявления таких генов служат сами искусственные иРНК. Высокая гетерогенность раковых опухолей даже одной локализации делает принципиально важным молекулярную характеристику раковых клеток, которая позволит определить «чувствительные» опухоли и в дальнейшем индивидуализировать лечение. Этот фактор пока недостаточно учитывается при разработке таргетных препаратов.

Связь функциональной и структурной гетерогенности рака с терапевтическим лечением. Нами исследуются функциональные характеристики более 20 генов, участвующих в зарождении и развитии рака ряда локализаций. Для этих генов оптимизированы методы количественного определения уровня экспрессии, определяемой в здоровой и опухолевой тканях почки. Количественное определение экспрессии генов осуществляется с использованием ПЦР-РВ на приборе Step One Plus (Applied Biosystems- США). В частности, была сформирована панель генов, связанных с развитием рака почки. Критериями выбора генов служили значимость генов для развития рака почки, их присутствие в патогенной цепочке функциональных нарушений и наличие уже существующих таргетных препаратов к этим генам. Анализировали сформированные панели генов, профили экспрессии которых свидетельствуют о функциональных процессах в опухоли конкретного больного. Результаты анализа профилей экспрессии могут быть использованы в качестве прогностических маркеров ответа на терапию, указывая на потенциальные мишени терапевтического воздействия. Нами были получены сравнительные (в раковой и здоровой ткани) профили экспрессии генов для ряда больных. Наиболее часто повышенный уровень экспрессии при раке почки из 12 исследованных генов наблюдается в генах VEGFR1, VEGFR2 и VEGF, указывая на частую необходимость блокирования генов, связанных с процессами ангиогенеза. Повышенная экспрессия хотя бы двух из указанных генов наблюдалась во всех исследованных случаях, в половине случаев были активированы все три указанных гена. Обнаружено частое понижение экспрессии гена PDGFR? при раке почки. На рис. приведен пример уровней экспрессии ряда генов исследованной панели в опухоли больного с раком почки по отношению к уровню экспрессии в нормальной ткани почки этого же больного.

width="351" alt="Уровни экспрессии ряда генов в опухоли рака почки относительно экспрессии в нормальной ткани почки" />

Рис.

Уровни экспрессии ряда генов в опухоли рака почки относительно экспрессии в нормальной ткани почки

.

По оси абсцисс даны гены: 1 –VEGFR1, 2 – VEGFR2, 3 – VEGF121, 4 – PDGFR?, 5 – PDGFR?,

6 – PI3K, 7 – PTEN, 8 – AXL, 9 – mTOR, 10 – EGFR.

По оси ординат – отношение уровней экспрессии указанных генов в опухоли и в нормальной ткани. Отрицательные значения даны для наглядности и отражают меньшие значения экспрессии в опухоли по сравнению с нормальной тканью.

Уровень экспрессии наиболее выражено (на один-два порядка величины) отличался в опухоли по отношению к здоровой ткани в генах VEGFR1 и PDGFR?. Причем самый низкий уровень экспрессия гена PDGFR? (в 500 раз ниже нормы) соответствовал наименьшему изменению экспрессии гена VEGFR1 в опухоли по сравнению со здоровой тканью. И наоборот, неизмененный уровень экспрессия гена PDGFR? соответствовал увеличенному примерно в 80 раз уровню экспрессии гена VEGFR1 в опухоли. В исследованных образцах опухолей не были найдены изменения экспрессии в генах PDGFR? и PI3K. В половине случаев опухолей была повышена экспрессия гена EGFR. Наблюдали как повышенную в 4 раза в опухоли экспрессию гена РТЕN, так и пониженную в 2,5 раза относительно контрольной ткани. В двух случаях была повышена экспрессия гена AXL, что свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания.

Рядом авторов данного сообщения проводится определение экспрессии гена HER2, важного для принятия решения об использовании герцептина (трастузумаба) при лечении рака молочной железы, и гена PTEN, с уровнем экспрессии которого связана эффективность герцептина. Если рак молочной железы устойчив к герцептину при потере экспрессии гена PTEN, то при раковой опухоли мозга – мультиформной глиобластоме применение рапамицина, наоборот, эффективно. Низкая экспрессия гена BRCA1 свидетельствует об увеличенной выживаемости при химиотерапии немелкоклеточного рака легкого с использованием гемицитабин/цисплатин. Для эффективной терапии, помимо функциональных характеристик раковых клеток, важно учитывать и структурные изменения в их геноме. В этом плане нами проводится определение мутаций в генах KRAS, PTEN и BRAF, актуальных для прогнозирования эффективности таргетной терапии при раке ряда локализаций (рак толстой кишки, легких, Т-клеточный лейкоз, меланома и т.д.), молекулярное определение рекомбинации BCR-ABL.

Проведено исследование мутаций в гене EGFR при раке легкого в связи с эффектом терапевтического воздействия. В опухолевой ткани больных в 24% случаев выявлены соматические мутации в гене EGFR, две из которых были новыми. Наиболее частая в европейских странах мутация L858R встретилась лишь однажды. Больные с мутациями получали лечение гефитинибом (иресса).

При наблюдении в течение 1,5 лет выжили все больные с мутацией в гене EGFR, в то время как в группе без мутаций выживаемость была низкой. Из полученных результатов следует необходимость определения мутаций в гене EGFR при раке легкого для повышения эффективности лечения этого заболевания. Для повышения эффективности лечения и минимизации побочных эффектов существенны не только изменения в геноме претерпевающей малигнизацию клетки, но и наследуемые особенности генов.

В частности, определяемые нами полиморфные варианты в гене CYP2D6 связаны с ответом на тамоксифен при раке молочной железы, вариант в гене UGT1A1*28 – со степенью гематоксических эффектов при использовании иринотекана.

Отдельной строкой в этом ряду стоят гены-супрессоры наследственной предрасположенности к раку. В этом направлении нами выявлены характерные для российских больных спектры и частоты мутаций генов-супрессоров, развита генодиагностика наследственной предрасположенности к основным социально-значимым локализациям рака. Однако наследуемые мутации в ряде генах-супрессорах важны также для выбора и прогноза эффективности средств химиотерапии. Примеры такой зависимости даны в табл. 1.

Таблица 1

Мутации в генах-супрессорах рака и средства терапии

Малые интерферирующие РНК в эффективной индукции апоптоза раковых клеток. Примером взаимосвязи разных структурных характеристиках генома раковых клеток и функции генов сигнальных путей служит следующий анализ. Мы исследовали эффекты подавления функционального проявления некоторых генов с помощью мaлых интерфирирующих РНК (миРНК) в клеточных линиях РТК: НТ-29 и СаСо2. Существенной характеристикой линии НТ-29 является наличие мутации в гене АРС, который является также наследственной причиной этого рака. В линии клеток СаСо2 мутация в гене АРС отсутствует. В соответствии с этим мы обнаружили, что экспрессия гена с-Мус в клетках НТ-29 приблизительно в 5 раз больше, по сравнению с экспрессией в клетках СаСо2. После трансфекции клеток миРНК и подавления функции гена с-Мус наблюдали апоптоз в клетках НТ-29 (17%, это в 3раза больше по сравнению с контролем). Подавление гена с-Мус в культуре СаСо2 не приводило к значимому различию в числе апоптотических клеток по сравнению с контролем. При индукции апоптоза с использованием теплового шока (44 0С, 40 мин), нокдаун гена с-Мус приводил к увеличению числа апоптотических клеток. В то же время, апоптотический эффект после теплового шока был более выражен при ингибировании с помощью миРНК функции гена HSPA5 (представителя семейства белков теплового шока 70, HSP70), в обеих клеточных линиях, по сравнению с эффектом подавления гена с-Мус.

Одновременное подавление вышеуказанных генов приводило к апоптозу 90% клеток в культуре НТ-29 и 60% клеток СаСо2, что значительно превышает эффект теплового шока без подавления этих генов. Полученные данные демонстрируют различный эффект от подавления активности одних и тех же генов в раковых клетках в зависимости от структурных изменений в их геноме, а также значение изученных генов для развития способов лечения РТК, особенно опухолей, связанных с мутациями в гене АРС.

Было проведено исследование по стимулированию апоптоза раковых леток с помощью подавления экспрессируемой РНК ряда генов. Нокдаун генов достигался с помощью микро РНК (siRNA) длинной в 19-22 пар оснований и коротких петлевых РНК (shRNA), экспрессируемых в составе векторов. Определяли усиление апоптотического эффекта действия химиотерапевтических средств и спонтанный апоптоз в результате нокдауна генов на клеточных линиях рака толстой кишки. Был проведён ряд повторно воспроизводившихся экспериментов по РНК интерференции ингибиторов апоптоза (IAP), задействованных в каспазном цикле. В результате работы было показано, что совместная экспрессия анти – IAP-2 и FLIP shRNA при малых дозах оксалиплатина даёт соизмеримый эффект с отдельной 3–кратной дозировкой (LD40) оксалиплатина. «Коктейль» из shRNA (анти – IAP-2 и FLIP) и siRNA (анти IAP-5 и HspA5) приводит к апоптотической гибели клеток, количество которых в 2 раза превышает число апоптотических клеток при действии оксалилплатина указанной выше дозировки. Разные комбинации siRNA и shRNA с LD40 дозой оксалиплатина приводят к 68% апоптотической гибели клеток по сравнению со стандартными 10% в отрицательном контроле и 18% при LD40 оксалиплатина. Полученные данные демонстрируют, что интерферирующие РНК ингибиторов апоптоза могут рассматриваться в качестве перспективного инструмента для разработки новых средств терапии рака, а также для усиления терапевтического эффекта, вызываемого стандартной химиотерапией, и снижения её нагрузки на организм пациента.

Функциональные процессы в микроокружении опухоли. В последнее время растет число данных о влиянии микроокружения на процессы зарождения и развития злокачественной опухоли. Например, показано, что изменение экспрессии генов сигнального пути hedgehog, ассоциированного с развитием рака в ряде тканей, происходит не в самих раковых клетках, а в прилежащей ткани (Yach et al., Nature, 2008, V. 455, P. 406-410). Эти данные рассматриваются как важные для разработки новых методов терапии рака (Curran and Ng., Nature, 2008, V. 455, P. 293-294). Мы исследовали экспрессию генов BRCA1 и BRCA2, а также рецептора эстрогена (ER) в различных образцах ткани яичников: раковой опухоли, примыкающей к опухоли здоровой ткани и ткани, отдаленной от опухоли.

Уровень экспрессии генов указанных генов определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Было обнаружено, что в трети исследованных случаев экспрессия ген ER была максимальна в примыкающей к опухоли ткани относительно экспрессии в раковой опухоли и в нормальной ткани. Экспрессия гена BRCA1 в опухоли рака яичников относительно отдаленной от опухоли ткани была снижена в основном числе случаев.

Понижение экспрессии гена BRCA1 в опухоли статистически значимо, что не наблюдается для гена BRCA2. Полученные результаты соответствуют роли гена BRCA1 при наследственной форме рака яичников и указывают на его значение в развитии спорадической формы рака этой локализации.

В около опухолевом окружении экспрессия гена BRCA1 была снижена в сравнении с экспрессией в опухоли в 67% случаев. В тех же образцах соотношение экспрессии гена BRCA2 в опухоли и около опухолевом пространстве было обратным относительно экспрессии гена BRCA1.

Результаты впервые демонстрируют взаимосвязь экспрессии генов-супрессоров BRCA1 и BRCA2 в тканях злокачественной опухоли и в около опухолевом пространстве. Обнаруженное явление свидетельствует о связи функциональных процессов в раковой опухоли и в окружающей ее ткани и, учитывая супрессорную и регуляторную роль генов BRCA1/2, об их важности для развития рака.

Полученные данные важны для понимания взаимодействия опухоли и ее микроокружения и могут быть востребованы при разработке новых способов терапии рака яичников.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!