Днк-чип для диагностики раковых клеток первичной опухоли и микрометастазов по плазме крови от пациента

Так как диссеминация раковых клеток начинается с узелка из этих клеток в 1-2 мм в диаметре, то излечение рака возможно лишь на пути его ранней диагностики.

В XXI в. станут известными основные гены-маркеры и белки-маркеры, превращающие нормальную клетку в раковую. По ним будет проводиться ранняя диагностика раковых клеток.

Ранняя диагностика рака – это диагностика его начала. Еще важнее диагностика рака до его начала.

«До начала» – это клетка, в которой уже эпимутации генов свойств клетки и мутации или эпимутации генов-супрессоров и генов репарации ДНК. Это предраковая клетка. Она морфологическими методами исследования не отличается от нормальной.

«Начало» – это первая раковая клетка, из которой затем образуется ее потомство, т.е. рак.

Изменения в генах и эпимутации – это метки или маркеры раковых клеток. По ним отличают раковые клетки от нормальных.

В тканях организма часть раковых клеток погибает от апоптоза или некроза, а их мутантные и эпимутантные гены через лимфу попадают в кровь. За счет мозаичности капилляров опухоли, начиная с узелка раковых клеток в 1-2 мм в диаметре, часть раковых клеток из стенки сосуда легко попадает в кровь. Какие-то из клеток остаются живыми в крови, а другие погибают, но оставляют свой след – фрагменты генов с мутациями и эпимутациями.

Так как ДНК вне клеток в нормальных условиях нет, то обнаружение в плазме крови или других жидкостях от пациента – моча, слюна, слезная жидкость и др. генов-маркеров, равнозначно обнаружению их носителя, т.е. раковых клеток.

Кровь пациента – главный резервуар, куда попадает ДНК из раковых клеток разных тканей организма.

В XXI в. ДНК-чип по генам-маркерам позволит обнаруживать дефектные клетки конкретной болезни, в том числе и рака. За короткое время – часы, а не дни, это устройство позволит найти любые и все изменения в генах раковой клетки или клеток задолго до симптомов рака.

В предыдущем разделе мы обсуждали биочипы, здесь мы выделим цели ДНК-чипа.

Ген – это фрагмент молекулы ДНК из двух цепей нуклеотидов- основной частью нуклеотида является какое-то одно из четырех оснований: А, Т, Г, Ц.

Цепи нуклеотидов гена удерживаются вместе за счет комплементарности пар оснований: А с Т, Г с Ц. Их связывает друг с другом спонтанный процесс образования водородных связей между ними. Это явление – образования пар оснований, называется гибридизацией. На этом явлении основан принцип действия ДНК-чипа.

Для этого молекулы-пробы выделяют из раковой клетки или из образца плазмы крови от пациента. Их метят флуоресцентным красителем и с помощью робота вносят в ячейки чипа.

Молекулы-зонды на чипе способны вылавливать из молекул-проб только комплементарную себе молекулу, т.е. вторую цепь нуклеотидов определенного гена.

Если среди молекул-проб такая молекула окажется, то она гибридизуется с молекулой-зондом. Это можно наблюдать: ячейка начинает светиться – тем сильнее, чем больше будет гибридизованных молекул. В этом суть принципа «работы» этого чипа.

Но для обнаружения присутствия в организме раковой клетки или клеток в молекулах-зондах на чипе должны содержаться все возможные эпимутации и мутации определенного гена в дополнение к нормальной копии этого гена на чипе.

Впервые в практике явление гибридизации пар оснований применил Эд. Саузерн в 1975 г. Он использовал меченую молекулу-пробу для определения комплементарной цепи нуклеотидов гена среди молекул-зондов, фиксированных на чипе. Это был прототип ДНК-чипа. В конце 1980-х гг. наш ученый – акад. А.Д. Мирзабеков идею гибридизации молекул реализовал в нашей стране в создании ДНК-чипа.

Для каких основных целей можно использовать ДНК-чип?

1. Для определения, какие гены в нормальной клетке каждого типа активны, а какие «молчат».

2. Для сравнения активности генов в нормальной клетке данного типа с активностью генов в раковой клетке этого типа. Это даст возможность выявить гены-причины раковой клетки.

3. Выяснять, зависят ли изменения генов раковой клетки – дефекты их или изменения их экспрессии, от типа клетка.

4. Определить, изменения каких генов и в чем встречаются в раковой клетке чаще других.

5. Контроль лечения рака и его излечения по исчезновению в плазме крови от пациента генов-маркеров раковой клетки.

Виды мутаций

1. Замена – это замена одной пары оснований в молекуле гена на другую. Пример: А-Т на Г-Ц.

2. Вставка – это дополнительная пара оснований или даже несколько их в ген. Пример: новая пара оснований А-Т в ген.

3. Делеция – выпадение одной или нескольких пар оснований в гене. Пример: Г-Ц в последовательности оснований где-то отсутствует.

Мутация в гене выразится в его продукте, т.е. в его белках – изменена последовательность аминокислот в белке. Если этот ген в норме регулирует деление клетки, то в случае мутации в этом гене такая клетка может стать раковой.

Раковая клетка может возникать из нормальной клетки не только от эпимутаций и мутаций в ряде генов, но и в результате чрезмерной активности гена. Это приводит к избытку в клетке числа копий этого гена, т.е. иРНК, а значит, нормального по строению, но избытка этого белка.

Пример: ген c-myc во многих типах клетки активирует РНК-полимеразу III типа в 12-15 раз по сравнению с обычной, и этим ведет к превращению нормальной клетки в раковую.

В каждом случае рака у пациента необходимо определять «молекулярные причины» свойств его раковых клеток: изменения экспрессии в них генов, в том числе генов инвазии, мутации и эпимутации в генах-супрессорах и репарации ДНК.

Как найти мутацию гена с помощью ДНК-чипа?

Для выявления в гене какого-либо вида мутации, в молекулы-зонды надо внести все виды мутаций этого гена во время синтеза молекул. После этого их размещают в ячейках ДНК-чипа.

Из клеток или здесь образца плазмы крови пациента готовится смесь ДНК-пробы. Каждую из них молекулу метят флуоресцентным красителем и роботом вносят в ячейки известного гена.

Если в ячейке произойдет гибридизация молекулы-зонда с молекулой- пробой, то лунка начнет светиться. Из этого будет вывод: в гене из образца плазмы есть эпимутация или мутация. А это означает, что в организме пациента есть раковая клетка или клетки.

Зная, какой ген в этой ячейке и какая в нем мутация или эпимутация, а также сравнив его с нормальной копией гена в контрольной ячейке на чипе, мы узнаем какой измененный ген в плазме крови пациента.

Измерение степени свечения в гелевой лунке укажет нам на титр мутантного или с эпимутацией гена в образце плазмы крови: чем меньше титр, тем меньше раковых клеток в организме пациента.

Как определить экспрессию гена с помощью ДНК-чипа?

Геном человека расшифрован и главная задача ученых – как можно скорее выяснить функции каждого гена в клетке каждого типа и для организма в целом.

Для определения активности гена в клетке, в лунках чипа фиксируются одноцепочные молекулы ДНК, т.е. «половинки» генов. На чипе размером 1 см2 можно расположить до 10 тысяч генов.

Как работает чип, мы уже знаем. При гибридизации со второй цепью данного гена, т.е. со второй его «половинкой», образуется двухцепочная ДНК.

Она отличается от одноцепочных участков тем, что способна «цеплять» половинки молекулы гена с флуоресцентным красителем, светящимся в специфичной для него области спектра. Так происходит высвечивание активных генов в клетке.

Откуда берется вторая цепь гена? Ее можно получить из исследуемой клетки, которая в разные промежутки своей жизни и функций включает и разные «наборы» генов в своем геноме. Для нашей цели ее получают из плазмы крови от пациента, куда попадают фрагменты генов из погибших раковых клеток.

Известно, что активные гены синтезируют на своей матрице молекулы информационной РНК, т.е. иРНК. Затем эти молекулы используют для синтеза белков.

С помощью фермента «обратной транскриптазы» из вирусов рака, с иРНК получают копию в виде одноцепочной ДНК, т.е. вторую «половинку» гена – кДНК.

Роботом в ячейки чипа переносят молекулы-пробы, т.е. кДНК. Если молекула-зонд комплементарна кДНК, то между ними происходит гибридизация с образованием двухцепочного гена. Такая ячейка или ячейки на чипе начнут светиться. Чем больше степень свечения в гелевой ячейке, тем больше титр этого гена в плазме от пациента, а значит, больше раковых клеток.

Обнаружение раковой клетки или клеток в образце плазмы крови от пациента по маркерам: эпимутации и мутации генов или амплификация генов, да- ет возможность выявлять рак у пациента в самом его начале и даже до его начала, т.е. задолго до появления его симптомов. Низкий титр генов-маркеров в плазме крови пациента при анализе на ДНК-чипе должен означать минимальное количество предраковых и/или раковых клеток в его организме.

ДНК-чипы позволяют получить «профили» экспрессии генов в каждом типе нормальной или дефектной клетках. С их помощью уже удалось выяснить, что для нормальных и раковых клеток эти профили различны.

Превращение нормальной клетки любого типа в раковую после действия на нее какого-либо канцерогена. Но когда, и на какую клетку и где в организме человека подействовал канцероген или продукты окисления кислорода, что, может быть, чаще всего, нам всегда неизвестно.

Но при этом раковые клетки обладают одинаковыми зловещими свойствами вне зависимости от типа клетки и от класса канцерогена, вызвавшего ее образование. Это и заставляет думать, что раковая клетка любого типа может возникать от одних и тех же изменений в генах.

Если это подтвердится, тогда легче создать минимальный набор генов- маркеров, вызывающих превращение нормальной клетки любого типа в раковую клетку. Гены-маркеры разместят в качестве молекул-зондов в ячейках ДНК-чипа и фиксируют в них. В будущем каждый человек может носить на руке такой чип того же крохотного размера. Чип будет дополнен микросхемой для анализа его информации.

Постоянные, но не редкие в течение года анализы плазмы его крови и других биологических жидкостей на эпимутации и другие изменения генов этого набора, позволили бы выявлять самое «преддверие» рака, т.е. его «начало», а еще надежнее – «до начала» его.

При выявлении такого «преддверия» рака, на наш взгляд, следовало бы начать профилактическое лечение такого пациента для уничтожения этих первых предраковых и/или раковых клеток в организме пациента. Ряд методов для этой цели уже разработан, но в клиническую практику они лишь начинают «входить».

Выбор препаратов и средств должен определяться молекулярными причинами образования раковой клетки у конкретного пациента. Эти причины будут мишенями для лекарств и средств. Среди них, могли бы быть: моноклональные антитела, нормальные копии генов-супрессоров и генов апоптоза с помощью модифицированного вируса, в будущем – мТКР с лекарственным веществом, малые интерферирующие РНК для разрушения иРНК генов-причин и другие. Это важно, так как место образования таких клеток в организме пациента на этапах – «начало» и тем более – «до начала», нельзя найти никакими методами, кроме методов на основе генов-маркеров и белков-маркеров раковых клеток.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!