Отримання моноклональних антитіл

Видео: Лечение моноклональными препаратами

Сьогодні для підвищення специфічності антитіл використовують моноклональні антитіла.

Відомо, що В-лімфоцити, що синтезують антитіла, не можуть тривалий час культивуватися у культурі in vitro. Розв`язання даної проблеми полягало у створенні гібридної клітини. Одержавши генетичну складову від В-клітини, ця гібридна клітина була б здатна продукувати антитіла, а отримавши здатність до поділу від клітин сумісного типу - рости в культурі. Було відомо, що В-лімфоцити іноді перероджуються і стають раковими (мієломними) клітинами, набуваючи здатності до росту в культурі, водночас зберігаючи багато властивостей В-клітин. Отже, було вирішено клітини мієломи, у першу чергу ті, що не виробляють власні антитіла, поєднати з нормальними антитілопродукуючими В-клітинами.

Перший крок у процесі одержання гібридної клітинної лінії, що продукує антитіла однієї специфічності, починається з введення мишам антигену, тобто імунізації. Після циклу імунізації, проведеного протягом кількох тижнів, перевіряють, чи відбувся у тварин розвиток імунної відповіді. Якщо відповідь розвинулася, то у тварин вилучають селезінку, промивають її, подрібнюють і легко струшують для вивільнення поодиноких клітин,серед яких знаходяться й антитілопродукуючі В-клітини. Клітини селезінки змішують з суспензією спеціальних мієломних клітин, дефектних (мутантних) за ферментом гіпоксантингуанін-фосфорибозилтрансферазою (ГТФРТ~). Таку суспензію впродовж кількох хвилин інкубують у 35 %-му розчині поліетиленгліколю, а потім переносять у середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище ГАТ). Оброблення поліетиленгліколем полегшує злиття клітин, проте воно відбувається рідко і є досить випадковим. У суміші є клітини мієломи, селезінки, а також гібридні (ті, що злилися) клітини мієломи-селезінки, мієломи-мієломи, селезінки-селезінки. Однак у середовищі ГАТ ростуть тільки гібридні клітини мієломи-селезінки, усі ж інші типи клітин гинуть. Клітини селезінки і клітини селезінки-селезінки, що злилися, взагалі не ростуть у культурі in vitro, а дефектні (мутантні) мієломні клітини ГГФРТ" і клітини мієломи-мієломи, що злилися, не можуть використовувати гіпоксантин як попередник у процесі біосинтезу пуринових основ гуаніну й аденіну, без яких синтез нуклеїнових кислот неможливий. Однак у них є інший альтернативний природний шлях синтезу пуринів - за участі дигідрофолатредуктази,тому до складу середовища і входить аміноптерин, що інгібує активність цього ферменту. Таким чином, мієломні клітини ГГФРТ - і клітини мієломи-мієломи, що злилися, не можуть синтезувати пурини в середовищі ГАТ і гинуть.

Клітини, селезінки-мієломи, що злилися, ростуть у середовищі ГАТ, оскільки клітини селезінки постачають функціональний фермент ГГФРТ, що надає гібридом! здатності до утилізації екзогенного гіпоксантину середовища, незважаючи на блокування синтезу пуринів за участю дигідрофолатредуктази аміноптерином, та за рахунок здатності клітин мієломи до активного поділу. Тимідин необхідний для усунення блокування в синтезі піримідинів, зумовленого інгібуванням дигідрофолатредуктази. На 10-14-ту добу після злиття клітин у середовищі ГАТ залишаються і ростуть лише злиті гібридоми селезінки-мієломи. Потім їх вносять у лунки пластикових планшетів і вирощують на повному культуральному середовищі без ГАТ.

Після злиття й отримання гібридоми потрібно провести ідентифікацію (скринінг) гібридних клітинних ліній, що секретують специфічні антитіла до антигену, який було використано для імунізації. Для цього зазвичай проводять скринінг культуральних середовищ, що містять антитіла, наприклад імуноферментним методом. Середовище з тих лунок, у яких є антитілосекретуючі гібридоми, відбирають і переносять у лунки іншого мікротитрувального планшету, що були попередньо вкриті шаром молекул антигену-мішені. Якщо в культуральному середовищі є антитіла (перші антитіла), що розпізнають один з епітопів даного антигену, то вони зв`язуються з антигеном і залишаються в лунках після їхнього відмивання. Потім у лунки додають другі антитіла, специфічні до мишачих (перших) антитіл. Вони будуть приєднуватися до будь-яких антитіл, зв`язаних з антигеном.

В імуноферментному аналізі, що найчастіше використовується для скринінгу, до других антитіл (антимишачих) попередньо приєднують фермент, здатний розщеплювати субстрат і перетворювати незабарвлений хромоген (це все компоненти реакційної суміші) на забарвлену сполуку. Зміна кольору в одній із лунок свідчить, що вихідне культуральне середовище містило антитіла, специфічні до даного антигену. Якщо ж таких антитіл у середовищі не було, то другим антитілам ні з чим буде зв`язуватися і вони видаляються при другому відмиванні. Хромоген у таких лунках залишиться незабарвленим.

Середовище лунок вихідного мікротитрувального планшету, яке дає позитивну імунну відповідь(зміна кольору), може містити суміш клітин, що злилися. Для одержання лінії, яка походить від однієї клітини (клони), клітинну суспензію з таких лунок розводять культуральним середовищем і висівають в інші лунки. Після культивування отриманих клонів середовища знову тестують, визначаючи, яка з клітинних ліній (гібридом) продукує моноклональні антитіла, що розпізнають антиген-мішень. У тому випадку, коли отримують більше однієї специфічної гібридоми, проводять подальші дослідження, що дозволяють визначити, чи спрямовані антитіла, які виробляються різними клонами, проти однієї і тієї ж антигенної детермінанти. Кожен клон, що продукує моноклональні антитіла, можна підтримувати в культурі практично нескінченно. Крім того, зразки можна заморозити в рідкому азоті і використовувати їх надалі як джерело клітин.

Іноді гібридоми культивують в організмі мишей. Для цього гібридому вводять у черевну порожнину мишей сумісної генетичної лінії, попереднього пригнітивши їхню імунну систему, наприклад, вводячи мінеральне масло. Гібридома (власне злоякісна пухлина) приживається у черевній порожнині миші, починає розмножуватися і синтезувати велику кількість антитіл, які можна виділити з асцитної рідини.

Одержані за гібридомною технологієюмоноклональні антитіла мають абсолютно однакову специфічність, належать до одного класу, підкласу імуноглобулінів і є практично стандартними препаратами, характеристики яких не залежать від умов утримання тварин, їхніх індивідуальних особливостей та ін. У зв`язку з цим сьогодні моноклональні антитіла широко використовуються як компоненти діагностичних препаратів, нові типии вакцин, для виділення надчистих препаратів деяких речовин та у багатьох інших сферах, про які буде згадано нижче.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!