Біосинтез інтерферонів у клітинах генетично модифікованих організмів

Клонувати гени інтерферону було значно складніше, ніж гени деяких білків (наприклад інсуліну), у перших успішних експериментах, проведених за допомогою генної інженерії. Послідовність амінокислот перших рекомбінантних молекул (інсулін, гормон росту) була відома, тоді як щодо інтерферону такі відомості були відсутні. Тому почали пошук можливих шляхів одержання інтерферону на основі його противірусної активності.

У 1989 р. Є. Гілберту і K. Вайсману (Бостон, США) вдалося отримати інтерферон людини у генетично модифікованих мікроорганізмах. Цей дослід ґрунтувався на спостереженні, що при ін`єкції мРНК з інтерферонпродукуючих лімфоцитів у гігантські ооцити Хепорus в останніх синтезується інтерферон. Було визначено розмір матричної PHK альфа-інтерферону. Для цього полі-А-вмісну PHK з інтерферонпродукуючих клітин фракціонували, окремі фракції вводили в ооцити і визначали противірусну активність білкових продуктів. Активність була визначена при ін`єкції в ооцити 12S PHK, і саме цю фракцію у подальшому використали для конструювання бібліотеки кДНК в плазміді pBR322. Було перевірено близько 20 000 клонів E. соlі, отриманих при трансформації плазмідами бібліотеки, та ідентифіковано послідовності шляхом гібридизації індивідуальних клонів кДНК з альфа-інтерфероновою мРНК методом соузерн-блотингу. Спочатку виділяли великі групи, з яких потім селектували менші підгрупи у межах даного клону. Для доведення того, що кДНК кодує саме інтерферон, її вбудовували в бактерію і реєстрували противірусний ефект її білкового екзопродукту. Одразу після одержання рекомбінантного альфа-інтерферону тими ж методами було клоновано кДНК бета- та гамма інтерферонів.

мРНК альфа-інтерферону складається з 836 нуклеотидів, серед яких 72 і 203 припадають на 5`-та З`-ділянки, що не транслюються- 63 нуклеотиди кодують лідерний пептид, що відповідає за секрецію інтерферону з клітин. 498 нуклеотидів кодують 166 амінокислотних залишків молекули інтерферону.

мРНК бета-інтерферону складається з 865 нуклеотидів. 242 нуклеотиди містяться на З`-кінці, що не транслюється. Лідерна послідовність складається з 23 амінокислот (69 нуклеотидів). 498 нуклеотидів кодують 166 амінокислотних залишків молекули бета-інтерферону. Встановлено, що альфа- та бета-інтерферони близькі за нуклеотидним складом. Гени альфа-інтерферону належать до великої генної родини, що кодує різні субтипи альфа-інтерферону, а також його неактивні форми. Було клоновано лише один ген бета-інтерферону. Усі гени і псевдогени альфа-інтерферону, а також єдиний ген бета-інтерферону локалізовані у 9-й хромосомі. Деякі з них тісно зчеплені між собою. Жоден із генів альфа-інтерферону і ген бета-інтерферону не містять інтронів. Бета- і деякі альфа-інтерферони глікозильовані.

У перших успішних генно-інженерних експериментах синтез інтерферонів був малоактивний. Підвищити активність можна було за рахунок використання інших векторів або потужніших промоторів. Це вдалося здійснити, використовуючи конструкції, що включали промотор лак-оперону. Продукція підвищилась у десятки разів, що дало змогу отримувати 1 мг інтерферону з 1 л культури. Одразу після вдалих експериментів з E. Соїі були використані еукаріотичні моделі – дріжджі роду Saccharomyces. Саме на прикладі альфа інтерферону показана можливість експресії генів людини у клітинах дріжджів. При трансформації Saccharomyces використали конструкцію, що здатна ефективно реплікуватися як в клітинах дріжджів, так і в бактеріальних клітинах – так звані човникові вектори. У даному експерименті ген альфа-інтерферону об`єднували з геном алкоголь-дегідрогенази дріжджів, що має потужний промотор. Для дріжджової системи характерний дуже високий вихід. Крім того, глікозилювання та дозрівання молекул білків у дріжджів відбуваються за тими ж принципами, що й у інших еукаріотів. Це особливо важливо для одержання рекомбінантних білків людини.

Клонування генів гамма-інтерферону. Клонування генів гамма-інтерферону виявилося найскладнішим. По-перше, було важко індукувати продукування гамма-інтерферону. Препарати мРНК з селезінки людини, в яких за допомогою бактеріального токсину було індуковано продукування гамма-інтерферону, розділяли за розмірами і вводили різні фракції в ооцити Хепорus. Було отримано 18S мРНК, продукт трансляції якої мав антивірусну активність. На її основі було створено кДНК, яку ввели в E. соїі у складі космідного вектора. Рекомбінантні молекули розмножували в клітинах E. Coli і добивалися їх експресії. Клони використовували для селекції відповідного хромосомного гена в бібліотеці кДНК людини у векторах на основі фага лямбда. Таким чином, було ідентифіковано і секвеновано ген гамма-інтерферону. Він має 3 інтрони та 4 екзони, є унікальним і міститься у єдиній копії в 12-й хромосомі. Відсутність інтронів у генах альфа- і бета-інтерферонів має велике значення, оскільки вони синтезуються в інфікованих вірусом клітинах. Вони не залежать від сплайсингу, який в інфікованій клітині може бути порушений.

При одержанні гамма-інтерферону встановлено, що він ефективно продукується рекомбінантними клітинами (E. соїі - 25 000 од./л, дріжджі -1 000 000 од./л). На сьогодні відомі роботи із синтезу гамма-інтерферону в клітинах мавп, однак зі значно меншим виходом.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!