Мутація у вірусів

Видео: Вирус Эбола Начал Мутировать. 2014

Віруси змінюють свої властивості як у природних умовах розмноження, так і в експерименті. В основі спадкоємної зміни властивостей вірусів можуть лежати два процеси: 1) мутація, тобто зміна послідовності нуклеотидів у визначеній ділянці генома вірусу, що веде до фенотипічної вираженої зміни окремої властивості, і 2) рекомбінація, тобто обмін генетичним матеріалом між двома близькими вірусами, але вірусами що відрізняються між собою по спадкоємних властивостях.

Мутація — мінливість, зв`язана зі зміною самих генів. Вона може мати переривчастий, стрибкоподібний характер і призводить до стійких змін спадкоємних властивостей вірусів. Усі мутації вірусів поділяються на дві групи: спонтанні й індуковані- по протяжності їх поділяють на крапкові й абераційні (зміни, що торкаються значної ділянки генома). Крапкові мутації обумовлені заміною одного нуклеотиду (для РНК-вмістимих вірусів) чи однієї пари комплементарних нуклеотидів (для ДНК-вмістимих вірусів). Такі мутації можуть іноді піддаватися реверсії з відновленням вихідної структури генома. Однак мутаційні зміни здатні захоплювати і більш великі ділянки молекул нуклеїнових кислот, тобто декілька нуклеотидів. У цьому випадку теж можуть відбуватися випадання, вставки і переміщення (транслокації) цілих ділянок і навіть повороти ділянок на 1800 (інверсії), зсув рамки зчитування - більш великі перебудови в структурі нуклеїнових кислот, а отже, і порушення генетичної інформації.

Слід зазначити, що не завжди крапкові мутації реалізуються, тобто приводять до зміни фенотипу. Мається ряд причин, у силу яких такі мутації можуть не виявлятися. Одна з них — виродження генетичного коду.

Природа користається своєрідною мовою синонімів і, заміняючи один кодон іншим, вкладає в них те саме поняття (амінокислоту), зберігаючи, таким чином, у синтезованому білку його природну структуру і функцію.

Мутації можуть мати різні наслідки. В одних випадках вони ведуть до зміни фенотипічних проявів у нормальних умовах. В інших випадках мутація є летальною, тому що внаслідок її порушується синтез чи функція життєво важливого вірусоспецифічного білка, наприклад вірусної полімерази. У деяких випадках мутації є умовно летальними, тому що вірусоспецифічний білок зберігає свої функції у визначених, оптимальних для нього умовах і втрачає цю здатність у непермісивних умовах. Типовим прикладом таких мутацій є температурно-чуттєві (temperature-sensitive) — ts-мутації, при яких вірус утрачає здатність розмножуватися при підвищених температурах (39—42 °С), зберігаючи цю здатність при звичайних температурах вирощування (36—37 °С).

Морфологічні чи структурні мутації можуть стосуватися розміру віріону, первинної структури вірусних білків, зміни генів, які детермінують ранні і пізні вірусоспецифічні ферменти, що забезпечують репродукцію вірусу.

По своєму механізму мутації можуть бути теж різними. В одних випадках відбувається делеція, тобто випадання одного чи декількох нуклеотидів, в інших — відбувається вбудовування одного чи декількох нуклеотидів, а в деяких випадках — заміна одного нуклеотиду іншим.

Мутації можуть бути прямими і зворотними. Прямі мутації змінюють фенотип, а зворотні (реверсії) — його відновлюють. Реверсія не є рідкою подією, тому що ревертанти здебільшого більш пристосовані до даної клітинної системи. Тому при одержанні мутантів із заданими властивостями, наприклад вакцинних штамів, приходиться вважатися з можливою їхньою реверсією до дикого типу.

Спонтанні мутації. У живій природі мутації виникають надзвичайно рідко і спонтанно, тобто під впливом причин, важко встановлюваних у кожнім окремому випадку. Спонтанні мутації у вірусів виникають у популяції без втручання з боку експериментатора. Не може бути абсолютно однорідних популяцій. Однорідність відносна, тому у вірусній популяції в процесі її розвитку спонтанні мутанти виникають з визначеною імовірністю.

Частота мутацій того самого ознаки може бути різної в залежності від штаму. Частота прямих мутацій у вірусів коливається в широких межах. Мутанти, що виникають у популяції, не залишаються генетично чистими лініями, а іноді можуть швидко розмножуватися і практично цілком витиснути інші складові популяції. Частота мутацій у вірусів залежить і від клітинної системи, у якій відбувається розвиток вірусної популяції. Одночасно клітинна система може бути і фактором селекції (добору варіантів).

Спонтанні мутації можуть виникати внаслідок таутомерного перетворення основ, що входять до складу ДНК. Так, наприклад, таутомерні зрушення в положенні атома водню в аденіну призводить до того, що аденін при реплікації спаровується не з тиміном, а з гуаніном. Така помилка при спарюванні основ приводить при наступних реплікаціях до заміни пари AT і ГЦ.

Спонтанні мутації, що виникли в тому самому гені, розподіляються по його довжині нерівномірно. Одні ділянки гена піддаються мутації часто, і їх називають «гарячими» крапками, інші— рідко. Тому імовірність помилок при спарюванні основ у різних ділянках гена різна. Це може бути зв`язане з визначеною конформацією нуклеїнової кислоти, і окремі нуклеотиди можуть з більшим ступенем імовірності піддаватися таутомерному перетворенню, чим інші. Крім того, спонтанні мутації при реплікації можуть бути обумовлені помилками в роботі ферментів – ДНК- чи РНК-полімераз.

У вірусів мутантні популяції можуть виникати й у результаті адаптації їх до незвичайних біологічних систем in vitro (культури клітин) і in vivo (тварини, курячі ембріони).

Мутації при пасажах на тварин. Прикладів одержання стабільних високоімуногенних штамів вірусів методом тривалої адаптації до лабораторних, природно сприйнятливих чи несприйнятливих тварин багато. Так, Л.Пастером був отриманий вакцинний штам (virus fixe) сказу. Шляхом серійних пасажів цього вірусу (штаму Флюрі) через мозок одноденних курчат і далі в курячих ембріонах (при зараженні їх у жовточний мішок) удалося одержати штам, апатогенний для кроликів, мишей і собак (варіанти Нер і Lep). Тривале пасажування вірусу чуми великої рогатої худоби через організм кіз привело до ослаблення його вірулентності для сприйнятливих тварин. Так був отриманий у 1948 р. аттенуйований варіант вірусу, що знайшов застосування для вакцинації великої рогатої худоби (штам Едвардс). Аналогічним чином Накамура і Міямато адаптували до кролика вірус чуми великої рогатої худоби (штам L), який і нині застосовують у якості високоефективної живої вакцини. Тривалими внутрішньовенними пасажами на кроликах удалося одержати кілька вакцинних штамів вірусу чуми свиней.

Віруси грипу найбільш мінливі як в експериментальних, так і в природних умовах. У результаті серійного пасажування їх на мишах (при інтраназальному зараженні) вірус здобуває високу патогенність для цих тварин і разом з тим утрачає патогенність для людини. В адаптованих до мишей штамів змінюється не тільки вірулентність, але і ряд інших властивостей: чутливість до інгібіторів, терморезистентність, імуногенні й інші властивості, що свідчить про глибокі зміни спадковості вірусу. Пасажами на мишах і морських свинках удалося перетворити вісцеротропну природу вірусу чуми коней у нейротропну й одержати нешкідливі для коней вакцинні штампи. При тривалому пасажуванні вірусу ящуру в організмі новонароджених кроленят чи мишенят він згодом аттенуювався у відношенні великої рогатої худоби, не змінюючи при цьому типовій приналежності.

При адаптації вірусів до природно сприйнятливих видів тварин чи до гетерогенних тканин експериментально-сприйнятливих тварин вирішальне значення в успіху роботи мають вид і вік тварини, спосіб уведення вірусу і його властивості.

Змінилося представлення і про спектр патогенності багатьох вірусів при експериментальному зараженні, і зокрема вірусу ящуру, що, як з`ясувалося, можна безупинно пасажувати на новонароджених мишенятах, кроленятах і кошенятах, хоча дорослі тварини цих видів до даного вірусу несприйнятливі.

Для успіху адаптації вірусів до організму лабораторних тварин істотне значення має ослаблення резистентності їхніх хазяїнів шляхом впливу кортизоном, температурою, ?-опроміненням і т.п.

Мутації при пасажах на курячих ембріонах. Спадкоємна мінливість вірусів спостерігалася і при пасажуванні їх на курячих ембріонах. Так були отримані вакцинні штами для профілактики інфекційного бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту птахів, чуми собак, катаральної лихоманки овець, чуми великої рогатої худоби, ньюкаслської хвороби й ін.

Мутації при пасажах у культурах клітин. У культурах клітин і тканин успішно вирощуються й піддаються аттенуації багато вірусів. Так, після тривалого пасажування в культурі тканини курячих ембріонів, вірус жовтої лихоманки втратив нейротропні і вісцеротропні властивості, зберігши імуногенність. Отриманий у такий спосіб штам 17Д і дотепер успішно використовують як живу вакцину. Удалося одержати ряд аттенуйованих штамів вірусу поліомієліту (трьох типів) шляхом пасажування в культурі клітин нирки мавп. Вакцина, виготовлена з цих штамів, нешкідлива для людей, викликає напружений і тривалий імунітет, що забезпечує несприйнятливість до циркулюючого в природі дикого штаму вірусу поліомієліту. За останні роки з`явилося багато повідомлень про одержання спадково ослаблених імуногенних штамів ящуру, інфекційного ринотрахеїту, вірусної діареї, міксоматозу кроликів і парагрипу-3 великої рогатої худоби при адаптації до різних видів культур клітин.

Причини виникнення мутацій у процесі адаптації. Зміна властивостей вірусу в процесі пасажів відбувається поступово. У перших пасажах виявляють головним чином віріони, що змінили яку-небудь одну генетична ознака- із збільшенням пасажів у популяції виявляють віріони, які змінили дві і більш генетичних ознак- у подальших пасажах кількість таких часток постійно зростає, і надалі в переважної більшості вірусних часток спостерігається зміна багатьох генетичних ознак. Це свідчить про те, що в основі механізму спадкоємної мінливості вірусної популяції при пасажах лежать два процеси — мутація і селекція, причому й у тім і іншому процесі важливу роль грає зовнішнє середовище, що є одночасно індуктором мутації і селективним фактором .

Якщо гетерогенну вірусну популяцію, що має в складі змінені і вихідні вірусні частки, культивувати в звичайних умовах, то це призводить до її реверсії. Причому, як показали дослідження з аттенуйованими штамами вірусів реверсія змінених ознак може бути зв`язана не тільки з гетерогенністю вірусної популяції, але і з наявністю в генетично однорідній популяції часток вірусу, що володіють низькою стабільністю спадкоємних властивостей.

Факти, що нагромадилися, в області мінливості вірусів не відповідають сталому в літературі визначенню «спрямована мінливість», тому що фактично експериментатор передбачуваної спрямованості біологічних властивостей вірусу не має. Навпаки, нагромадилося велике число фактів про мінливість вірусу, спричиненої хазяїном (host-controlled variation). Ці зміни полягають у тім, що клітина впливає на характер синтезованих у ній компонентів вірусу. Такі модифікації не торкаються нуклеотидної послідовність вірусного генома. Склад білків, закодованих у вірусному геномі, може модифікуватися клітиною-хазяїном. Це обумовлено наявністю в клітині особливих мутагенних форм тРНК (sPHK), у яких порушена нормальна відповідність між антикодоном і здатністю захоплювати визначеному, відповідному цьому антикодону амінокислоту.

Таким чином, клітина-хазяїн може істотно впливати на фенотип вірусу чи блокувати ( частково або цілком) його репродукцію.

Мінливість вірусу в природі. Прикладом такого роду мінливості може служити природна мінливість антигенної структури (гемаглютиніну і нейрамінідази) вірусів грипу людини і тварин (у тому числі птахів), а також вірусів ящуру. Вихідні штами вірусу грипу А2 (1968—1970 р.) і варіанти цих штамів спочатку не розрізнялися між собою за антигенною структурою, біологічною і гемаглютинуючої активності, термостабільності, здатності розмножуватися при 40 °С. Однак пізніше штами, що відносяться до антигенних підгруп А2/1, А2/2 і А2/3, виявили зміну не тільки антигенної структури, але й інших біологічних властивостей цього збудника. Всім добре відома природна мінливість вірусу грипу, яку в останні роки зв`язують з утворенням рекомбінантів вірусів грипу людини і тварин.

В даний час відомо 11 варіантів вірусу ящуру типу О, 32 варіант типу А, 5 — у типу С, 7 — у типу CAT 1 і по 3—у типів CAT 2 і CAT 3. Штами вірусу ящуру типу Азія 1 також неоднорідні за антигенною структурою. У ході епізоотії відбувається як зміна варіантів у межах одного типу, так і зміна самих типів вірусу. В інших вірусів також спостерігається природна мінливість, хоча і менш помітна, чим у вірусів грипу і ящуру і це свідчить про постійну еволюцію вірусів у природі.

Крім антигенної мінливості вірусів у природі, еволюція захоплює і патогенні властивості їх. Життєвий цикл вірусів незрівнянно коротший, ніж життєвий цикл їхніх хазяїнів, тому еволюційні зміни у вірусних популяціях можуть відбуватися в короткі проміжки часу і мати найважливіші наслідки: чи підвищення, чи послаблення вірулентності збудника. Це можна проілюструвати на прикладі варіабельності патогенності епізоотичних штамів вірусу ньюкаслської хвороби. З першою появою ця хвороба в Європі протікала гостро, з високим відсотком загибелі птахів. В даний час усе частіше реєструються вогнища з низькою летальністю і легким перебігом хвороби. Відбувається не тільки зниження кількості вогнищ, але й аттенуація епізоотичних штамів, що дозволило дослідникам виділити природно-ослаблені вакцинні штами B1, La Sota, F, Бор-74 ВДНКІ. Є багато повідомлень про виділення природно-ослаблених штамів вірусів чуми свиней, хвороби Ауескі (штам Русс), міксоматозу кроликів і кліщового енцефаліту.

Індуковані мутації. Виникають вони при дії на вірус різними хімічними і фізичними мутагенами, а також у процесі адаптації його до незвичайних біологічних систем (при адаптаційній мінливості). Методи адаптації вірусу до незвичайних біологічних систем часто вимагають тривалих зусиль, результати яких важко передбачати, а контроль і керування процесом мінливості не завжди піддаються волі експериментатора.

З тих пір, як установлено, що спадкоємні властивості вірусів визначаються числом і послідовністю розташування нуклеотидів у молекулі нуклеїнових кислот, виникла перспектива одержання живих вакцинних штамів не опосередкованим впливом через змінений обмін речовин макроорганізму, курячий ембріон, культуру кліток, а безпосереднім впливом на них фізичними чи хімічними мутагенами, що викликають структурні і функціональні зміни в молекулі вірусної нуклеїнової кислоти. Застосування штучних мутагенів має свої переваги. По-перше, вони викликають мутації в десятки і сотні разів ефективніше, ніж природні фактори, і, по-друге, дія деяких штучних мутагенів має відому спрямованість, що дозволяє заздалегідь передбачати, на які елементи структури нуклеїнових кислот і яким чином діє той чи інший мутаген і які зміни в них викликає.

Хімічні мутагени. Запропоновано три класифікації хімічних мутагенів: Рехборна (1960), Фріза (1960) і А. Раппопорта (1961). Фріз запропонував розділити мутагени на дві основні групи: 1) мутагени, що реагують з нуклеїновою кислотою тільки під час її реплікації (аналоги пуринових і піримідінових основ)- 2) мутагени, що вступають у реакцію зі спочиваючою молекулою нуклеїнової кислоти, але потребуючі для формування мутацій наступних її реплікацій (азотиста кислота, гідроксиламін, алкіліруючі з`єднання) .

В останні роки синтезований і вивчений ряд хімічних сполук — супермутагенів (нітрозопохідних сечовини — нітрозогуанідин і його похідні).

Молекулярні механізми, мутагенної, дії хімічних сполук. В основі молекулярних змін вірусної нуклеїнової кислоти, що призводять до мутації, лежать два основних процеси: заміна основи і випадання чи вставка основи. Фріз розрізняє два типи заміни основ, що входять до складу вірусної нуклеїнової кислоти: просту (транзиція) і складну (трансверсія). При простій заміні на місце однієї пуринової основи встає інша (наприклад, замість аденіну — гуанін) чи одна піримідинова основа заміняється іншою (цитозін - урацилом). Такі заміни відбуваються при індукції мутацій азотистою кислотою. При складній заміні (трансверсії) замість пуринової основи з`являється піримідинова чи піримідинова основа заміняється пуриновою.

Іншої, процес — випадання (розподілу) чи вставка основ — веде до більш глибоких змін генетичного коду, чим проста заміна основ. Мутаційні ушкодження в одній ділянці генома нерідко приводять до зміни декількох генетичних ознак, що мають різне фенотипічний прояв (плейотропія). У той же час основою зміни генетичної ознаки, що має те саме фенотипічне вираження (наприклад, здатність розмножуватися при підвищеній температурі), можуть бути мутаційні ушкодження різних генів.

Для вірусів людини і тварин мутагеном є і формальдегід, за допомогою якого були індуковані мутанти у вірусу поліомієліту і вірусу західного енцефаломієліту коней при впливі відповідно на очищену РНК і внутрішньоклітинний вірус. Механізм мутагенної дії формальдегіду недостатньо вивчений.

Мутагенна дія азотистої кислоти. Серед речовин, що хімічно змінюють основи в молекулі нуклеїнової кислоти, найбільше добре вивчені азотиста кислота і гідроксиламін. Механізм дії азотистої кислоти (HNO2) як мутагену на нуклеїнові кислоти полягає в дезамінуванні органічних основ, тобто відщіпленні від їх молекул аміногрупи (NH2). У результаті дії азотистої кислоти аденін (А) перетворюється в гіпоксантін (Гк), гуанін (Г) - в ксантін (К), а цитозін (Ц) - в урацил (У). Внаслідок цієї реакції в дезамінованих органічних основ виникають нові властивості.

Фізичні мутагени. Мутагенна дія підвищеної температури. Температура (40—50 °С) сприяє видаленню пуринів (переважно гуаніну) із ДНК. При реплікації такої ДНК навпроти пролому, викликаним утратою пурину, у ланцюг, що синтезується, можуть бути включені будь-які нуклеотиди. Якщо включиться основа, якої на цьому місці раніше не було, то це означає появу мутації (транзиції чи трансверсії).

Мутагенна дія ультрафіолетового випромінювання. Дія ультрафіолетових променів (УФП) як мутагенів полягає в тому, що вони взаємодіють з молекулами нуклеїнових кислот і поглинаються ними, особливо промені з довжиною хвилі 260—280 нм. Потрапляючи в молекулу нуклеїнової кислоти, вони поглинаються органічними основами. Виявилося, що тимін (Т), урацил (У) і цитозин (Ц) більш чуттєві до ультрафіолетових променів, чим аденін (А) і гуанін (Г).

У результаті опромінення структура зазначених піримідинів змінюється. При опроміненні УФП дві сусідні молекули тимінів з`єднуються один з одним у пари, утворюючи тимінові димери.

Фактори, що впливають на ефективність і спрямованість мутагенезу. Таких факторів, принаймні, вісім: 1) природа мутагену- 2) специфічні особливості вірусу- 3) період взаємодії вірусу з клітиною- 4) число наступних реплікацій вірусу після впливу на нього мутагеном- 5) вибірковість взаємодії мутагену з генами вірусу- 6) умови обробки (рН середовища, її склад, температура)- 7) тип клітинної системи- 8) умови культивування.

В однакових умовах експерименту той самий мутаген може неоднаково індукувати мутації в різних вірусів і навіть штамів того самого вірусу. Мутабельність різних ознак під дією того самого мутагену навіть у межах одного штаму різко розрізняється.

Ефективність і специфічність дії мутагенів залежать від концентрації мутагену, рН, сольового складу середовища і ряду інших факторів. Для багатьох мутагенів виявлена пряма залежність між інтенсивністю мутагенезу і дозою мутагену. Однак зі збільшенням дози і посиленням мутагенного ефекту знижується і виживання вірусу. Існує математична залежність між величиною, що визначає частоту мутацій, і виживанням останнього.

Індукований мутагенез залежить також і від складу живильного середовища, у якій знаходиться система вірус-клітина.

Вплив зазначених мутагенних факторів на нативний вірус виявилася менш ефективним, що обумовлено меншою доступністю вірусної нуклеїнової кислоти впливу хімічних мутагенів, нездатних проникати через білкову оболонку вірусу.

Про стабільність мутантів. Не всі мутації, що утворюються під впливом мутагенів, однаково стабільні. Мутанти, отримані при дії підвищеної температури, кислого середовища, ультрафіолетових променів і ультразвукових хвиль, давали близько 20% реверсій, при впливі профлавіну всі мутанти виявилися цілком стабільними. Ці розходження в стабільності зв`язані з неоднаковим молекулярним механізмом дії використаних мутагенів. Підвищена температура, кисле середовище, ультрафіолетові промені викликають головним чином локальні зміни вірусної нуклеїнової кислоти, що ведуть до заміни окремих основ. При одержанні вакцинних вірусних штамів шляхом впливу на вірус мутагенами доцільно використовувати мутагени, що викликають більш глибокі зміни генетичного коду - типу випадення чи вставок, тому що такі мутанти володіють стабільністю спадкоємних властивостей.

Добір мутантів для генетичного аналізу. При роботі з мутагенами важливою ланкою є не тільки індукція, але і виділення мутантів. Добір мутантів роблять на основі аналізу ознак даного вірусу. Однак не всяка нова ознака, що виникає при мутації, придатна для генетичного аналізу. Придатні лише ті ознаки, що легко виявляються, досить стабільні і контролюються одиничною мутацією. У вірусів тварин такі складні ознаки, як патогенність, вірулентність, антигенна структура, контролюються не одним, а багатьма генами.

В даний час добір мутантів вірусів тварин проводиться на основі аналізу умовно летальних мутацій. Всі умовно летальні мутанти даного класу (наприклад, усі ts - мутанти) володіють однією загальною ознакою і фенотипічно в більшості випадків нерозрізнені. Однією з причин виникнення ts-чутливості в результаті мутації є те, що змінюється первинна структура якого-небудь білка, наприклад ферменту. Причому ця зміна така, що при пермісивній температурі фермент працює, а підвищення (зниження) температури змінює його конформацію сильніше, ніж конформацію білка дикого типу, і призводить до відсутності ферментативної активності в мутантного білка.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!