Исследование экспрессии и статуса метилирования гена р3а-адаптинапри раке шейки матки

После установления полного размера CpG-островка гена вЗА-адаптина мы провели исследование взаимосвязи между метилированием этого CpG-островка и транскрипцией ассоциированного с ним гена. Как известно, метилирование CpG-островка обычно сопровождается инактивацией транскрипции (см. раздел "Метилирование ДНК"). Поэтому задачами нашего исследования на данном этапе являлись изучение уровня экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина и подтверждение статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

Изменение уровня экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина мы изучали с использованием двух методов: блот-гибридизации РНК и амплификации кДНК, полученной обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). При гибридизации в качестве зонда к гену вЗА-адаптину мы использовали продукт ПЦР, включающий в себя последовательность первого экзона гена. Амплификацию кДНК проводили с использованием праймеров, расположенных в первом и во втором экзонах гена вЗА-адаптина, разделенных интроном, последовательность которого составляет 26856 п.н.

Изучение уровня мРНК вЗА-адаптина в образцах нормы и опухоли шейки матки мы проводили на препаратах тотальной РНК. Всего с помощью блот-гибридизации мы исследовали пятнадцать случаев рака шейки матки. И только в одном образце (номер 289) мы обнаружили заметное снижение количества мРНК вЗА-адаптина в опухоли по сравнению с нормой (рис. 16А). Небольшая частота снижения уровня мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях по сравнению с нормой может быть связана с тем, что, с одной стороны, это действительно редкое событие, а с другой - с убиквитарной экспрессией гена (Dell`Angelica et al. 1997) и присутствием в образцах

опухоли и нормы стромальных элементов (фибробластов, клеток крови и кровеносных сосудов) и возможной контаминацией нормальными клетками опухоли и наоборот.

Рисунок 16. Анализ экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина. А. Уровень мРНК в образце рака шейки матки. Верхний ряд - результат гибридизации тотальной РНК радиоактивномеченным зондом к первому экзону гена. Нижний ряд - фотография агарозного геля с тотальной РНК после электрофореза. Н - РНК из нормального эпителия- О - РНК из опухоли шейки матки одной и той же больной. Числами справа указано расположение рибосомальных РНК (28S и 18S). Б. Уровень мРНК в клеточных линиях HeLa и SiHa до и после обработки 5-азацитидином (5-azaC). Результат электрофореза в агарозном геле продуктов ОТ-ПЦР.

В связи с этим, мы исследовали изменение количества мРНК гена вЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки HeLa и SiHa после обработки их деметилирующим агентом 5-азацитидином с помощью ОТ-ПЦР и блот-гибридизации. 5-азацитидин является ингибитором ДНК-метилтрансферазы 1, которая осуществляет в клетке поддерживающие метилирование. При ее инактивации, происходит репликативно-зависимое деметилирование ДНК, включая и аберрантно-метилированные CpG островки. До недавнего времени было общепризнано, что таким способом возможно добиться восстановления экспрессии мРНК гена, если она подавляется за счет метилирования ДНК. Сравнение уровня мРНК мы проводили в необработанных и обработанных клетках одной и той же культуры. Результаты типичного опыта, полученные при применении ОТ-ПЦР, представлены на рисунке 16Б. Видно, что в клетках HeLa после обработки 5-азацитидином происходит реактивация транскрипции гена вЗАадаптина. В клетках SiHa увеличение уровня мРНК происходило в два раза. Исследование методом Нозерн-блоттинга подтвердило эти результаты (данные не представлены). Таким образом, мы установили, что при обработке клеток рака шейки матки HeLa и SiHa деметилирующим агентом происходит реактивация экспрессии гена /ЗА-адаптина. На основании этих опытов можно сделать вывод о том, что экспрессия мРНК /ЗА-адаптина существенно снижена, по крайней мере, в клетках HeLa и может быть активирована деметилирующим агентом. 2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена /ЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

Чтобы выяснить, как связана транскрипция гена /ЗА-адаптина с метилированием, мы исследовали статус CpG динуклеотидов, входящих в состав его CpG-островка, в клеточных линиях HeLa и SiHa. Для этого мы использовали метил-чувствительный ПЦР со специфическими праймерами (МЧ-ПЦР), гибридизацию по Саузерну и определение нуклеотидной последовательности бисульфитно-модифицированной ДНК. Как и в случае СП-ПЦР первые два метода подразумевают обработку ДНК метилчувствительными ферментами. При этом исследуются CpG динуклеотиды, входящие в состав сайтов рестрикции МЧР. Наибольшее число сайтов рестрикции в составе CpG островка гена /ЗА-адаптина наблюдается для ферментов HpaII (10) и HhaI (8). Статус метилирования сайтов рестриктаз HhaI и SacII мы изучали с помощью МЧ-ПЦР, рестриктазы HpaII - блот-гибридизацией.

Расположение сайтов рестрикции фермента HhaI и использованных в работе праймеров представлено на рисунке 17А. В случае применения праймеров 26-13 и 26-8, мы определяли статус метилирования CpG динуклеотидов в составе семи сайтов. Результат этого исследования представлен на рисунке 17Б. Отсутствие продуктов ПЦР при амплификации ДНК, обработанной рестриктазой HhaI, говорит о том, что хотя бы в одном из исследованных сайтов рестрикции CpG динуклеотид не подвергается

метилированию. Дробление первоначальной зоны исследований на более короткие отрезки с меньшим числом сайтов рестрикции (использовали комбинацию праймеров 26-14 и 26-8- 26-1 и 26-3) и, таким образом, уменьшение числа исследуемых за один раз CpG динуклеотидов ситуацию не изменило. Мы всегда наблюдали отсутствие продукта ПЦР, т.е. сайты рестриктазы Hhal оказывались рестрицированными. Таким образом, при исследовании статуса метилирования сайтов рестрикции фермента Hhal в границах CpG-островка гена вЗА-адаптина мы установили, что CpG динуклетиды, входящие в состав этих сайтов не метилированы в клеточных линиях HeLa и SiHa.

Рисунок 17. Анализ статуса метилирования CpG динуклеотидов, входящих в состав сайтов рестрикции метилчувствительного фермента Hhal в пределах CpG-островка гена вЗА-адаптина, с помощью МЧ-ПЦР. А. Схематическое изображение расположения сайтов рестрикции фермента Hhal (вертикальная черта). Стрелками обозначены использованные праймеры- ? - CpG островок, И - 1 экзон. Б. Результат электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации ДНК из клеточных линий с помощью праймеров 26-13 и 26-8. Рестрикция образцов ДНК Hhal (Hh) или без рестрикции (-). М - маркер 100 bp. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

Для изучения статус метилирования CpG динуклеотидов в сайтах рестриктазы HpaII мы использовали метод гибридизации ДНК по Саузерну. Здесь мы обрабатывали ДНК из клеточных линий метилчувствительной рестриктазой HpaII и, дополнительно, ферментом рестрикции Mspl, который является изошизомером HpaII, но не чувствителен к критическому для рестриктазы HpaII метилированию. При этом мы дополнительно исследовали

ДНК из клеток культур HeLa и SiHa, обработанных 5-азацитидином. Зонд для гибридизации представлял собой продукт ПЦР, который мы получили с помощью амплификации геномной ДНК с праймерами 26-1 и 26-3. На рисунке 18А представлено расположение сайтов рестрикции HpaII/MspI в исследуемом регионе гена и набор вариантов продуктов гибридизации,

А.

Рисунок 18.

Анализ статуса метилирования CpG динуклеотидов

, входящих в состав сайтов рестрикции метилчувствительного фермента HpaII в пределах CpG островка гена вЗА-адаптина, с помощью гибридизации по Саузерну. А. Схематическое изображение расположения сайтов рестрикции (вертикальная черта) по отношению к CpG островку -I | . Горизонтальными линиями обозначены варианты продуктов гибридизации. Число справа обозначает размер продукта. И - 1 экзон. Б. Результат гибридизации культур клеток рака шейки матки до и после обработки 5-азацитидином. Числами вверху рисунка обозначены: 1 - Hela, 2 - Hela+5azaC, 3 - Siha, 4 - Siha+5azaC. Рестрикция образцов ДНК HpaII (H) или MspI (M). Числами слева указаны размеры маркерных фрагментов.

которые будут наблюдаться при том или ином распределении метилирования сайтов рестриктазы HpaII. Рестрикция ферментом MspI является контролем, так как при этом образуется единственный продукт минимального размера 444 н.п. Результат гибридизации ДНК из клеточных культур представлен на рисунке 18Б. Видно, что в клетках HeLa при рестрикции как HpaII, так и MspI наблюдается один и тот же продукт (отмечен толстой стрелкой), что говорит об отсутствии метилирования сайтов HpaII в этих клетках. В случае клеточной линии SiHa возможно частичное метилирование одного-двух CpG динуклеотидов, так как при рестрикции ДНК ферментом HpaII отмечается дополнительная полоса большего размера, чем основной продукт (отмечен тонкой стрелкой). Таким образом, при изучении статуса метилирования CpG динуклеотидов в составе сайтов рестрикции фермента HpaII мы установили, что в клеточных линиях HeLa и SiHa большинство CpG динуклеотидов не метилировано.

CpG-островок гена вЗА-адаптина мы обнаружили с помощью СП-ПЦР по метилированию сайтов рестриктазы SacII. Поэтому представлялось возможным, что транскрипция гена вЗА-адаптина регулируется метилированием сайта какого-либо специфического транскрипционного фактора, содержащего сайт рестриктазы SacII. В последовательности CpG-островка гена вЗА-адаптина присутствуют два сайта рестрикции этого фермента, обозначенные нами как сайт 1 (S1) и сайт 2 (S2, рис. 19А). Для исследования статуса метилирования этих сайтов мы использовали праймеры 26-14 и 26-8 (S1), 26-1 и 26-3 (S2)- рестрикцию ДНК ферментом SacII проводили двукратно. Результаты амплификации представлены на рисунке 19Б. В двух клеточных линиях при изучении статуса метилирования сайта 1 мы наблюдали присутствие продукта ПЦР, а при исследовании статуса метилирования сайта 2 продукт ПЦР отсутствовал в тех же образцах ДНК. Однако, при исследовании статуса метилирования сайта 1 рестриктазы SacII в образцах нормы и опухоли шейки матки (амплификацию проводили с применением праймеров 26-7 и 26-8) выяснилось, что в шести из восьми образцов продукт ПЦР присутствовал не только в опухоли, но и в норме. Пример такого исследования представлен на рисунке 19В. В тоже время в случае сайта 2 продукта ПЦР для большинства этих образцов не было ни в норме, ни в опухоли. Такой результат может быть связан с одной стороны с метилированием этого рестрикционного сайта не только в опухоли, но и в нормальной ткани, а с другой стороны с тем, что данный сайт является труднорестрицируемым.

Рисунок 19. Анализ статуса метилирования CpG динуклеотидов, входящих в состав сайтов рестрикции метилчувствительного фермента SacII в пределах CpG островка гена вЗА-адаптина методом МЧ-ПЦР. А. Схематическое изображение расположения сайтов рестрикции фермента SacII (вертикальная черта). Стрелками обозначены использованные праймеры- ? - CpG островок, И - 1 экзон. Б. и В. Результат электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации ДНК из клеточных линий (Б) и из образцов нормы и опухоли шейки матки (В). Рестрикция образцов ДНК SacII (S) или без рестрикции (-). М -маркер 100 bp. Числами вверху указаны номера образцов, где Н - ДНК из нормальной ткани, О - ДНК из опухоли шейки матки- числами справа - размеры маркерных фрагментов.

В связи с этим мы использовали бисульфитный сиквенс ДНК, который позволяет точно установить статус метилирования каждого CpG динуклеотида, и не ограничен рамками сайтов рестрикции. При обработке ДНК бисульфитом натрия в молекуле цитозина происходит замещение атома водорода на гидросульфитную группу по углероду в шестом положении. Эта модификация приводит к резкому возрастанию скорости дезаминирования и к превращению после десульфонации остатка цитозина в остаток урацила. 5-метилцитозин таким превращениям не подвергается. Поэтому, после амплификации обработанной ДНК в продукте ПЦР происходит замена неметилированного остатка цитозина на остаток тимина, в то время как метилированный остаток цитозина остается самим собой, т.е. остатком цитозина. Исследование статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина таким способом мы проводили в клеточной линии HeLa и в образцах опухоли 286 и 289 (модифицированная бисульфитом натрия ДНК была любезно предоставлена сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Ивановой Т.А.). Амплификацию мы проводили полугнездовым способом с помощью трех праймеров, подобранных к модифицированной ДНК. На рисунке 20 схематически представлена исследуемая зона, а также приведены хроматограммы сиквенса участка CpG-островка длиной 86 н.п. в клетках HeLa и в образце опухоли 289 и немодифицированная нуклеотидная последовательность этого же участка. Видно, что в обоих случаях во всех шести приведенных CpG динуклеотидах остаток цитозина оказался замещенным на тимин, т.е. был неметилированным. Приведенный на рисунке сайт рестриктазы SacII представляет собой первый из двух расположенных в границах CpG-островка сайтов рестрикции этого фермента (сайт S1). По результатам применения МЧ-ПЦР данный сайт имел метилированный статус. Здесь же оба CpG динуклеотида, входящих в состав сайта, находятся в неметилированном состоянии. Таким образом, мы столкнулись с труднорестрицируемым сайтом рестриктазы SacII.

Обобщенные результаты, которые мы получили при изучении статуса метилирования участка CpG-островка гена |З3А-адаптина размером 411 н.п. с помощью бисульфитного сиквенса, выглядят следующим образом. Во всех трех случаях мы исследовали 26 CpG динуклеотидов. В клетках линии HeLa неметилированный статус имели 21 CpG динуклеотид. В образце опухоли 286 неметилированное число CpG динуклеотидов составило 23, в образце 289 неметилированными были 24 CpG динуклеотида. При этом следует заметить, что, в противоположность неметилированным CpG динуклеотидам, статус метилирования остальных исследованных CpG динуклеотидов однозначно определить было невозможно, так как хроматографическая картина сиквенса этих CpG динуклеотидов и окружающих их районов не имела достаточной четкости и ясности. Исходя из результатов, полученных нами тремя разными методами, можно заключить, что CpG-островок гена |З3А-адаптина не подвергается существенному метилированию в клеточных линиях рака шейки матки и в плоскоклеточных карциномах шейки матки.

Таким образом, с одной стороны экспрессию мРНК гена |З3А-адаптина можно реактивировать деметилирующим агентом в клеточных линиях рака шейки матки, а с другой стороны CpG-островок самого гена не подвергается аберрантному метилированию в этих же клеточных линиях. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что экспрессия мРНК |З3А-адаптина подавлена в клетках HeLa и SiHa, и в одной из 15 опухолей шейки матки, но это подавление экспрессии не связано с метилированием исследованного района CpG-островка гена |З3А-адаптина.

Обсуждение результатов

CpG-островки являются структурно-функциональными элементами генома. Как уже отмечалось нами ранее, они преимущественно располагаются на 5` концах генов в области нетранскрибируемых последовательностей промоторов, первых экзонов и интронов и, за некоторыми исключениями (импринтинг, инактивированная Х хромосома), не метилированы в нормальной клетке. Предпринятый в работе поиск CpG-островков с измененным статусом метилирования в опухолевых клетках по сравнению с нормальными позволил получить результаты, которые могут быть рассмотрены в двух аспектах. Представляется интересным оценить, во-первых, возможность использования метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами для выявления последовательностей, обладающих свойствами CpG-островков, во-вторых, способность метода дифференцировать метилированные и неметилированные CpG-островки.

С помощью использованного метода было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: CpG-островок 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5` конец гена вЗА-адаптина), CpG-островок 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных. Отсутствие CpG-островков в банках известных последовательностей связано, по-видимому, с трудностями секвенирования GC-богатых фрагментов ДНК стандартными методами, а также с тем обстоятельством, что CpG-островки с высокой частотой встречаются в горячих точках рекомбинации, вследствие чего могут утрачиваться при клонировании (Kong et al. 2002). Это может быть связано также с использованием NotI-клонотек для построения крупномасштабных физических карт генома человека. В последнее время было обнаружено, что при создании таких клонотек утрачиваются относительно короткие фрагменты, содержащие кластеры сайтов узнавания крупнощепящей рестриктазы NotI, о существовании которых ранее не было известно (Домнинский и др. 1999). Утраченные фрагменты с большой вероятностью содержат CpG-островки, так как по расчетам около 90% сайтов узнавания NotI должны располагаться в CpG-островках (Lindsay and Bird 1987). Таким образом, использованный в работе метод скрининга GC-богатых последовательностей позволяет эффективно выявлять CpG-островки, в том числе и непредставленные в банках известных последовательностей генома, и может быть полезен для заполнения "белых пятен" в геноме человека.

Для оценки способности использованного метода идентифицировать дифференциально-метелированные CpG-островки необходим анализ их статуса метилирования в клеточных линиях и первичных опухолях шейки матки по сравнению с нормальными тканями. Такой анализ проведен для двух CpG-островков: CpG-островка 32, локализованного на 13 хромосоме, и CpG-островка 26, ассоциированного с геном вЗА-адаптина.

Для CpG-островка 32 метилированные аллели были обнаружены в лейкоцитах периферической крови носителей опухоли, в большинстве опухолей шейки матки и нормальных тканей, прилегающих к опухоли. Однако в 1 из 22 опухолей шейки матки наблюдалось отсутствие метилирования этого района. Таким образом, CpG-островок 32 действительно различно метилирован в некоторых опухолях и нормальных тканях. Обнаруженный характер метилирования CpG-островка 32 (присутствие метилированных аллелей в нормальных тканях) делает его вполне возможным кандидатом на роль CpG-островка, связанного с импринтированным локусом на хромосоме 13q34, и указывает на необходимость его дальнейшего исследования.

При подтверждении статуса метилирования CpG-островка, ассоциированного с геном вЗА-адаптина (фрагмент 26), было обнаружено расхождение между результатами методов, основанных на применении метилчувствительных рестриктаз и прямым определением метилцитозина путем бисульфитного секвенирования. В данном случае имела место устойчивость одного из сайтов узнавания метилчувствительного фермента SacII к действию фермента, несмотря на отсутствие метилирования цитозина в нем. Устойчивость к гидролизу этого сайта SacII была подтверждена на большом числе образцов ДНК и наблюдалась параллельно с полным гидролизом другого сайта SacII, расположенного в пределах этого CpG-островка. По-видимому, такая относительная устойчивость связана с особенностями структуры ДНК в GC-богатых районах, фланкирующих этот сайт. Так как скрининг дифференциально-метилированных фрагментов ДНК методом метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами основан на использовании метилчувствительных рестриктаз, необходимо принимать во внимание возможность неполной рестрикции, связанной с особенностями структуры GC-богатых районов. Таким образом, отбор дифференциально-метилированных CpG-островков данным методом возможен, но в сочетании с дополнительным тщательным анализом статуса метилирования идентифицированных CpG-островков, включающим большой набор метилчувствительных рестриктаз, а также методы, основанные на прямом определении 5-метилцитозина в последовательности. Возможность успешного скрининга этим методом изменений метилирования, ассоциированных с канцерогенезом, была также продемонстрирована другими авторами (Kohno et al. 1998- Liang et al. 2000).

Из 5 идентифицированных нами CpG-островков только один (CpG-островок 26) имел частичную гомологию с 5` концом известного гена вЗА-адаптина и был подробно нами исследован. В результате клонирования, определения нуклеотидной последовательности полноразмерного CpG-островка гена вЗА-адаптина, анализа его статуса метилирования и экспрессии был обнаружен следующий феномен. С одной стороны, было обнаружено подавление экспрессии мРНК вЗА-адаптина в одной из опухолей и в двух клеточных линиях рака шейки матки. При этом экспрессия мРНК вЗА-адаптина может быть активирована в клеточных линиях обработкой деметилирующим агентом 5-азацитидином. С другой стороны, анализ статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина с использованием метилчувствительных рестриктаз и прямым определением 5-метилцитозина секвенированием ДНК, обработанной бисульфитом натрия, выявил отсутствие существенного метилирования в клеточных линиях, первичных опухолях шейки матки и лейкоцитах периферической крови в районе промотора и первого экзона. Ген вЗА-адаптина представляет собой не единственный пример такого рода. Феномен непрямой активации экспрессии гена (в отсутствие метилирования CpG-островка гена) в результате обработки опухолевых клеток деметилирующими агентами 5-азацитидином и 5-аза-2`-дезоксицитидином был описан для генов Apaf-1 (Soengas et al. 2001), TIMP-2 (Cappabianca et al. 2003), TGF-p (Shin et al. 1992) и TGF-вЯП (Ammanamanchi et al. 1998). В трех последних случаях было показано, что активация экспрессии мРНК этих генов происходила вследствие активации транскрипционных факторов Sp1 и NF-Y.

Восстановление транскрипции генов, в том числе и вЗА-адаптина, под действием деметилирующих агентов может быть связано с двумя механизмами их действия. Во-первых, эти агенты вызывают деметилирование ДНК, ингибируя ферментативное метилирование цитозиновых остатков во вновь синтезированной цепи ДНК. Это приводит к дефициту 5-метилцитозиновых остатков по всему геному обработанных клеток. Вполне возможно, что в результате этого процесса происходит деметилирование и активация экспрессии регулятора транскрипции вЗА-адаптина, который был инактивирован метилированием в опухолевой клетке, что и было причиной подавления транскрипции вЗА-адаптина. Вполне возможно, что вЗА-адаптин опосредовано инактивируется в результате абберантного метилирования других районов ДНК в опухолевых клетках.

Во-вторых, недавно было показано, что 5-аза-2`-дезоксицитидин, независимо от его деметилирующего действия на ДНК, обладает также способностью подавлять лизин-специфическое метилирование гистонов и индуцировать быструю деконденсацию гетерохроматина (Takebayashi et al. 2001- Nguyen et al. 2002- Kondo and Issa 2003). Присутствие гистона Н3, метилированного по лизину в положении 9, является характерной чертой гетерохроматина и наблюдается на инактивированной Х хромосоме, в репрессивном хроматине во время развития и в районе генов, аберрантно-нетранскрибируемых при канцерогенезе (Boggs et al. 2002- Peters et al. 2002- Nguyen et al. 2002). Нельзя исключить, что вызываемое 5-аза-2`-дезоксицитидином деметилирование лизина 9 гистона Н3 и сопровождающее его ремоделирование гетерохроматина может при наличии соответствующих транскрипционных факторов в обрабатываемых клетках активировать транскрипцию генов, инактивация которых не связана с метилированием их промоторов.

Подавление транскрипции гена вЗА-адаптина в опухолевых клетках ранее не было описано. Вопрос о частоте этого события в первичных опухолях шейки матки требует дальнейшего исследования методами, позволяющими исключить взаимную контаминацию опухолевых и нормальных клеток, что важно из-за убиквитарного характера экспрессии гена (ОТ-ПЦР in situ, иммуногистохимия, микродиссекционные препараты

РНК).

Остается открытым вопрос о том, какие селективные преимущества может обеспечить опухолевой клетке подавление экспрессии одной из субъединиц комплекса АР3.

Белок p3A-адаптин представляет собой большую субъединицу гетеротетрамерного адаптерного белкового комплекса АР-3. Ген, продуктом которого является |З3A-адаптин, локализован на хромосоме 5 в зоне 5q14.1 и экспрессируется во всех исследованных тканях (Dell`Angelica et al. 1997). Всего у млекопитающих описано четыре таких комплекса: АР-1, АР-2, АР-3 и АР-4 (см. обзор Boehm and Bonifacino 2001). Каждый из комплексов состоит из 4 субъединиц: двух больших адаптинов (один из y/a/S/s и (31-4, соответственно), одного среднего адаптина (ц1-4) и одного малого адаптина (о 1-4). Также как и |33A-адаптин, белки адаптерных комплексов экспрессируются во всех клетках млекопитающих. Аналогичные субъединицы всех четырех комплексов гомологичны друг другу и имеют похожую доменную организацию, что предполагает и функциональное сходство. Они локализованы на мембранах органелл, осуществляющих экзо/эндоцитоз. АР комплексы принимают участие в образовании транспортных везикул, в узнавании переносимых белков и в вовлечении их в транспортные везикулы. Так АР-2, по-видимому, локализуется исключительно на плазматической мембране и осуществляет быстрый эндоцитоз активированных мембранных рецепторов. АР-1, АР-3 и АР-4, в свою очередь, располагаются на мембранах внутриклеточных компарментов, таких как транс-сеть аппарата Гольджи и эндосомы. Однако данные об исключительной локализации |33A-адаптина только в этой части аппарата Гольджи противоречивы (см. обзор Boehm and Bonifacino 2002). Комплекс АР-3 участвует в транспорте белков к лизосомам и родственным им органеллам. У млекопитающих сюда входят меланосомы и плотные тельца тромбоцитов (см. обзор Boehm and Bonifacino 2002). АР-1, АР-3 и АР-4 комплексы взаимодействуют с цитозольными доменами трансмембранных белков, однако, механизмы такого взаимодействия и его взаимосвязь со специфическим событием, составляющим сортировку белков, пока не понятны. Показано, что связывание с сигналами сортировки в транспортируемых белках могут выполнять fi и (3 субъединицы (см. обзор Robinson and Bonifacino 2001). Так, (3 субъединица узнает дилейциновый сигнал в аминокислотной последовательности белка-мишени (Rapoport et al.

1998).

Природные мутации S и (3 субъединиц адаптерного комплекса АР3 у мышей приводят к гипопигментации волосяного покрова и глаз, длительным кровотечениям и нарушениям в структуре лизосом (см. обзор Boehm and Bonifacino 2002). Такие фенотипические проявления являются отражением дефектов биогенеза меланосом, плотных телец тромбоцитов и лизосом, соответственно. У человека также обнаружены мутации гена вЗА-адаптина при синдроме Hermansky-Pudlak второго типа (HPS-2). Подобно мутантным мышам, у людей с этим синдромом наблюдается гипопигментация глаз и кожи, длительные кровотечения и нарушения в структуре лизосом. Как в мутантных мышиных клетках, так и в клетках от больных HPS-2 обнаружен ошибочный транспорт белков лизосомальной мембраны CD63 и lamp-1 через цитоплазматическую мембрану. Возможно, что наблюдаемые дефекты в АР-3-дефецитных клетках реализуются именно через неправильные сортировку или транспорт ряда трансмембранных белков в соответствующие органеллы. Хотя ген вЗА-адаптина экспрессируется убиквитарно, т.е. во всех тканях взрослого организма, его мутации приводят к фенотипическим проявлениям только в меланоцитах и тромбоцитах. Возможно, что в этих клетках комплекс АР-3 имеет какие-то специфические функции в дополнение к функциям, выполняемым во всех других клетках.

В последнее время появились свидетельства того, что белки везикулярного транспорта вовлечены в канцерогенез (см. обзор Floyd and De Camilli 1998). Описаны транслокации трех генов, продукты которых участвуют в эндоцитозе (AF1-p, EEN и CALM), при различных формах лейкозов. Однако, точные функции продуктов этих генов в эндоцитозе пока неизвестны. Амфифизины I и II участвуют в формировании клатрин-ассоциированных везикул. Амфифизин I гиперэкспрессирован при раке молочной железы. Амфифизин II связывается с протоонкогеном c-Abl и усиливает его трансформирующую способность.

Одним из возможных объяснений роли нарушений экспрессии белков везикулярного транспорта в канцерогенезе может быть возникающее вследствие этого нарушение экспрессии различных рецепторов на поверхности клеток. В пользу такой точки зрения говорят следующие экспериментальные факты. Показано, что клетки, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), неспособный подвергаться интернализации, обладают повышенным пролиферативным ответом на действие EGF (Vieira at al. 1996). Также продемонстрировано, что продукт гена Nef вируса иммунодефицита человека первого типа (HIV-1) способен индуцировать быстрый эндоцитоз CD4 рецептора с поверхности клеток и направлять его в лизосомы, последовательно взаимодействуя с комплексами двух типов AP и COPI, участвующими в везикулярном транспорте (Janvier et al. 2001). Иными словами, взаимодействие Nef с белками везикулярного транспорта приводит к нарушению нормального транспорта рецептора CD4 и подавлению его экспрессии на поверхности клеток. Таким образом, нарушение корректного везикулярного транспорта может существенно повлиять на экспрессию рецепторов на поверхности клеток.

Недавно с помощью системы двойных гибридов было обнаружено взаимодействие продукта одного из ранних генов HPV-16 белка Е2 с 8-адаптином. |33А-адаптин и 8-адаптин - это две большие субъединицы комплекса АР-3 (Boehm and Bonifacino 2001). Пока не показано существования взаимодействия Е2 и 8-адаптина в физиологических условиях в HPV-16-позитивных клетках опухолей шейки матки. Обнаруженное нами снижение экспрессии мРНК вЗА-адаптина в HPV-позитивных опухолях и взаимодействие вирусного белка Е2 с 8-адаптином указывают на необходимость исследования нарушений везикулярного транспорта в опухолях шейки матки.

Недостаток знаний о функциях комплекса АР-3 не позволяет пока однозначно ответить на вопрос о том, какие последствия для опухолевой клетки может иметь подавление экспрессии одной из его субъединиц - (33А-адаптина.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!