Пцр-ммк – метод ранней диагностики раковых клеток

Из первой раковой клетки за счет ее деления вначале в ткани образуется узелок в 1-2 мм в диаметре. Но уже с этого размера раковые клетки индуциру- ют внутри узелка ангиогенез и лимфангиогенез. С началом оттока крови и лимфы из узелка раковые клетки отделяются от него и с кровью и лимфой раз- носятся по организму пациента – рак становится болезнью всего организма па- циента.

Из этого следует, что диагностика рака, любого размера, видимого глазом и с помощью приборов – это поздняя диагностика. Пока в практике врача- онколога диагностика рака тогда, когда рак проявляет себя симптомами.

Ученые разных стран и нашей страны разными методами стремятся перейти к диагностике рака задолго до его симптомов. Именно на таком этапе болезни, можно надеяться на излечение от рака.

Нормальная клетка превращается в раковую после воздействия на нее какого-либо канцерогена. Это вызывает в ней изменения экспрессии генов, создающих ее свойства. Вторая причина – изменения экспрессии генов- супрессоров в этой клетке метилированием их промотора, а также мутации. Эти изменения происходят в генах, регулирующих процесс деления клетки, в генах, ингибирующих деление клетки при нарушениях в ее геноме, а также в генах, вызывающих апоптоз в таких клетках.

Каждый дефект в геноме раковой клетки является маркером такой клетки. Термин маркер (от англ. mark – метка). Диагностика первой раковой клетки и ее близких потомков по генам-маркерам – это ранняя диагностика рака у пациента.

Но как найти в организме пациента раковую клетку и ее потомки от первых делений среди 5 1013-14 клеток организма взрослого человека.

Как и любая клетка, раковая клетка микроскопического размера, возникнув в ткани, ничем не беспокоит пациента. За счет свойства к инвазии ее потомки распространяются в окружающие здоровые ткани и по всему организму, где, оседая, дают новые очаги рака – метастазы.

Задача диагностики разрозненных раковых клеток в тканях различных органов сопоставима даже не с поиском иголки в стоге сена, а с поиском конкретного пучка сена в этом стоге. Поэтому не нужно быть слишком большим пессимистом, чтобы предположить всю «тупиковость» такой ситуации в практике врача-онколога.

Но все изменил метод ПЦР, т.е. полимеразная цепная реакция, а в сочетании с ММК – методом молекулярных колоний, разработанным нашими учеными – чл.-корр. А.Б. Четвериным и Е.В. Четвериной (2002), стал для ранней диагностики весьма точным.

При любой локализации рака в кровь пациента попадают: а) сами раковые клетки – из стенок мозаичных капилляров узелка из раковых клеток в 1-2 мм в диаметре и б) гены-маркеры из погибших раковых клеток еще задолго до проявления как первичного очага рака, так и его метастазов. Это и позволяет выявлять рак у пациента с самого начала, т.е. с размера узелка в 1-2 мм в диаметре.

Еще в 60-70-х гг. XX в. Ф. Анкер (Ph. Anker) из Швейцарии сделал первые попытки доказать возможность обнаружения дефектных генов из раковых клеток в крови от пациента.

Наш ученый, проф. А.С. Белохвостов еще в 1960 г. XX в. обнаружил дефектные гены из раковых клеток яичника и желудка в асцитной жидкости. Он же с коллегами в 1978 г. XX в. доказал выход дефектных генов из раковых клеток в кровоток из опухолей в эксперименте на животных.

Теперь дефектные гены из раковых клеток обнаруживают с помощью ПЦР, а также ПЦР-ММК не только в крови, но и в других выделениях от пациента – слюна, слезная жидкость, слизь, мокрота, моча и др., в зависимости от типа раковой клетки.

Раковые клетки разрушаются в тканях за счет апоптоза как клетки с дефектами в геноме, а также при уничтожении Т-клетками. ДНК из них попадает в межклеточную жидкость, а из нее в кровь. В кровь попадают раковые клетки из первичного очага рака и метастазов. В крови они разрушаются, в том числе Т-клетками.

Молекулы ДНК и иРНК не могут быть вне клетки, в частности, раковой клетки, а раковая клетка не может быть без ДНК и иРНК. Поэтому выявление этих молекул является эквивалентом обнаружения их носителя – раковой клетки.

Точно также по молекулам ДНК, РНК диагностируют бактерии и вирусы – возбудителей различных инфекций у пациентов.

Выявление генов-маркеров раковых клеток в их ДНК является идеальным методом для ранней диагностики раковых клеток, контроля лечения и излечения, а также предсказания и диагностики рецидива и метастаза рака у пациентов.

ПЦР-диагностика раковых клеток по плазме крови

Процесс, благодаря которому можно получать копии генов из ДНК в неограниченном количестве, называют полимеразной цепной реакцией – ПЦР.

ПЦР открыл в 1983 г. американский ученый К. Мюллис (Kary B. Mullis), за что он был удостоен Нобелевской премии.

Мишенями ПЦР являются – фрагмент ДНК с находящимся в нем геном и иРНК – копия гена.

Цель ПЦР – размножить фрагмент ДНК из образца плазмы крови пациента, т.е. получить его копии, а также размножить иРНК до уровня, детектиру- емого стандартными методами. Чтобы размножить иРНК, ее сначала нужно с помощью обратной транскриптазы перевести в комплементарную ей ДНК, т.е. кДНК.

Таким методом можно обнаружить экспрессию гена или генов по уровню их мРНК, а также мутации в гене, что явилось причиной превращения нормальной клетки в раковую.

Принцип ПЦР

Для ПЦР-метода из клинического образца – плазмы крови выделяют смесь всех содержащихся там ДНК и РНК. Далее, чтобы понять принцип копирования этих молекул, нам не обойтись без некоторых знаний об их природе.

Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов, основной частью которых являются азотистые основания: аденин – А, цитозин – Ц, гуанин – Г и тимин – Т. Азотистые основания несут в себе генетическую информацию о структуре белков, а через них – строение клетки и ее функции, а также ее воспроизведение, т.е. деление на две дочерние клетки.

В английском языке есть слово ?complement? – дополнять, дополнение. От него в молекулярной биологии появился термин – комплементарность. Смысл его в том, что молекулы узнают друг друга участками, которые дополняют друг друга как «ключ и замок».

По этому принципу цепи нуклеотидов составляют комплементарную пару: А одной цепи всегда против Т другой цепи, а Г против Ц. Когда А и Т в двух цепях ДНК расположены друг против друга, между ними образуются две водородные связи. То же происходит с Г и Ц, но между ними возникает три водородные связи.

Из комплементарности пар оснований следует, что последовательность или порядок размещения азотистых оснований на одной цепи ДНК, определяет порядок азотистых оснований в ее другой цепи. Концы цепей ДНК химически различны: у каждой цепи есть 3’-конец и 5’- конец (Рис. 1, 2, 3).

Рис 1.

Фрагмент молекулы ДНК

.

Цепь ДНК, которая служит матрицей для синтеза матричной РНК называется матричной цепью.

Рис. 2.

Цепь мРНК – это копия матричной цепи ДНК

, последовательность азотистых оснований в ней та же, что и в нематричной цепи ДНК, но с заменой Т на У.

Цепь мРНК с помощью ПЦР размножают, но сначала ее с помощью обратной транскриптазы переводят в комплементарную ей матричную цепь ДНК – кДНК.

Рис. 3

. кДНК синтезирована на матрице мРНК – копии гена

.

Образование водородных связей между парами оснований: А-Т и Г-Ц – это спонтанный процесс, т.е. без участия фермента. Эти связи слабые и легко рвутся при нагревании – цепи ДНК отделяются друг от друга, а при охлаждении раствора – вновь спариваются в прежнее комплементарное состояние. Спонтанный процесс образования пар оснований А-Т и Г-Ц называют гибридизацией.

В основе ПЦР-анализа и лежит гибридизация пар оснований, как спонтанный процесс.

Выделенные из образца плазмы крови ДНК и иРНК являются мишенями для ПЦР. Их смешивают с реакционным буфером и другими компонентами ПЦР в специальную пробирку и помещают в прибор – ДНК-амплификатор, дающий циклические изменения температуры реакции.

Цикл ПЦР для размножения молекул-мишеней – ДНК и иРНК состоит из трех стадий:

1) расплавление двухцепочечной ДНК путем повышения температуры реакционной среды до 90° С-

2) зная порядок оснований на концах фрагмента ДНК, взятого для размножения, т.е. амплификации, синтезируют химическим путем олигонуклеотиды, комплементарные этим участкам – это праймеры-

3) присоединение праймеров к матрицам, т.е. к однотяжевым цепям ДНК, полученными в результате первой стадии. Температура реакционной среды – 50-60°С.

На этой стадии происходит удлинение, т.е. элонгация гибридизованных праймеров ДНК-полимеразой при температуре для работы фермента 70-75°С, что превращает каждую из цепей в двухцепочечную молекулу ДНК (Рис. 4).

Рис. 4.

Схема ПЦР

[рис. и цит. по: А.С. Белохвостов (1995) с изменения- ми]. На схеме цикл удвоения молекулы ДНК из исследуемого образца:

а – цепи исходной молекулы ДНК изображены двумя прямыми линиями-

б – после разделения цепей ДНК, к их концам присоединены по одному комплементарному праймеру в виде прямоугольника-

в – идет синтез новых цепочек ДНК.

ПЦР.

Примечание. Стрелками показано направление синтеза новых цепей в

По окончании одного первого цикла из одной молекулы двухцепочечной ДНК получены две, в следующем цикле каждая из двух молекул снова удваивается и так далее, с нарастанием числа молекул (N) по формуле: N = 2n, где n – число циклов. Отсюда и название реакции – цепная.

Теоретически ПЦР позволяет размножить до легко детектируемых количеств даже единственною молекулу-мишень ДНК, даже если она находится среди множества других молекул ДНК и РНК. Стандартная ПЦР постоянно совершенствуется.

Продукты ПЦР – молекулы ДНК, а значит гены и иРНК подвергаются анализу рядом методов, например электрофорезом в геле с окраской молекулы ДНК бромидом этидия и др. Определяются ген(-ы) и мутации в них: замена – пара оснований меняется на другую- вставка – в молекулу введена новая пара оснований- делеция – отсутствие пары комплементарных оснований в гене. По количеству копий иРНК гена судят о степени его экспрессии в клетке.

Различают два варианта ПЦР-диагностики: 1) качественный тест и 2) количественный тест.

Для качественного теста требуется лишь дать ответ: «да» или «нет», т.е. содержится ли в образце ДНК или иРНК. Для диагностики вирусной инфекции обычно достаточен факт обнаружения в образце вирусной ДНК или иРНК.

Для обнаружения раковой клетки в образце недостаточно, например, обнаружить иРНК, так как она может быть продуктом и нормальной, и раковой клетки.

Количественный тест определяет титр, т.е. число копий молекул- мишеней в определенном количестве образца, здесь крайне важны мишени – ДНК и иРНК.

Ведь для ранней диагностики рака крайне важно обнаружить его на самом раннем этапе – на уровне первой раковой клетки и ее первых потомков, а еще лучше на уровне предраковой клетки по генетическим маркерам в молекулах-мишенях – ДНК и иРНК. На уровне одной из этих клеток титр мишени будет минимальным.

Титр мишеней – ДНК и иРНК и их генетические маркеры необходимы:

1) для исследования молекулярных причин превращения нормальной клетки в раковую клетку в конкретном случае-

2) для слежения за течением скрытого еще рака на уровне первой раковой клетки и ее первых потомков, но также и для рака с симптомами-

3) для оценки эффективности лечения рака, коррекции лечения рака в процессе его лечения по состоянию генетических маркеров раковых клеток.

Чувствительность стандартной ПЦР разные авторы оценивают по- разному- причиной этого может быть и степень чувствительности ее в специфическом обнаружении молекул-мишеней, но и характер клинического образца – плазма крови, ткань опухоли, слюна, моча и другие различные выделения.

ПЦР-ММК-метод для ранней диагностики раковой клетки или клеток по плазме крови

Стандартная ПЦР может давать сбои и ошибки, в результате чего: 1) молекулы-мишени не будут выявлены из-за потери их в процессе подготовки образца-

2) молекулы-мишени могут быть не размножены в процессе ПЦР, тем более что в обычной клинической практике молекулы-мишени представляют незначительную долю среди ненужных матриц в образце.

Чл.-корр. А.Б. Четверин и Е.В. Четверина – сотрудники Института белка РАН – открыли метод молекулярных колоний – ММК, для прямого определения титра молекулы-мишени и пространственное разделение размножения нужных молекул-мишеней от ненужных. Этот метод запатентован учеными в РФ и в США (1995, 1998).

Принцип метода в том, что молекулы-мишени – ДНК и иРНК – размножаются не в жидкости, а в геле. Это создает отдельные колонии, каждая из которых является потомством единственной молекулы, т.е. клон.

ММК может сочетаться с ПЦР для размножения молекул-мишеней. Сначала гель полимеризуют, затем вымачивают в воде, чтобы удалить все растворимые вещества, затем автоклавируют и сушат.

Перед началом ПЦР гель пропитывают реакционной смесью. Этим авторы достигают полного сохранения активности ДНК-полимеразы и уничтожения молекул ДНК из окружающей среды, которые могли бы попасть в гель при его приготовлении. Синтез кДНК на молекуле иРНК может быть осуществлен отдельно или в геле. Для детекции мишеней используется универсальная реакционная смесь с ДНК-полимеразой (Рис. 5).

Рис. 5.

Схема проведения ПЦР-ММК

(рис. и цит. по: А.Б. Четверин, Е.В. Четверина, 2002).

1. а – лунка с высушенным полиакриламидным гелем-

2. б – пропитывание геля реакционным раствором, содержащим, в том числе, исследуемый образец и специфические праймеры-

3. в – инкубация геля в течение 30 мин при 55-65° С – условия обратной транскрипции, с последующими 40 циклами ПЦР-

4. г – промакивание геля нейлоновой мембраной – перенос колоний-

5. д – гибридизация мембраны с радиоактивно меченым зондом, специфичным к искомой мишени- получение радиоавтографа мембраны.

Как пишут авторы метода, «ММК позволяет преодолеть все проблемы стандартной ПЦР и впервые сделать ПЦР-диагностику действительно чувствительной, количественной и надежной» (2003).

Основные отличия ПЦР-ММК от стандартной ПЦР

1) Реакционную смесь для размножения мишеней – ДНК и РНК, вносят не в жидкость в специальной пробирке, а в лунку с пленкой высушенного полиакриламидного геля. В результате чего «потомство каждой молекулы образует колонию, а не распространяется по реакционному объему».

2) Каждая колония является клоном молекул, а число колоний прямо указывает «на число молекул ДНК или РНК, присутствующих в геле до начала реакции».

3) ПЦР-ММК фактически дешевле стандартной ПЦР: а) «многократно» сокращает число проб для проведения анализа- б) расход реактивов «почти ткой же»: объем геля – 65 мкл, в стандартной ПЦР объем реакционной смеси 50 мкл.

Для выполнения ПЦР-метода, а тем более ПЦР-ММК пригодны любая ткань, биологическая жидкость и выделения человека. По генным маркерам эти методы позволяют выявлять минимальное число раковых клеток при раке крови и лимфатической системы, так и при солидном раке. Это крайне важно для ранней диагностики раковых клеток первичного очага рака или метастазов, а также для выявления остатков раковых клеток после лечения рецидива рака.

Плазма крови от пациента является универсальным источником генных маркеров из раковых клеток любого типа клетки, т.е. любой локализации рака у пациента.

Повышение содержания генов-маркеров из раковых клеток в плазме крови при раке установлено многими исследователями.

Проф. Д. Сидрански (1994) считает, что ПЦР позволила совершить «генетическую революцию в ранней диагностике рака», подчеркивая следующее:

- рак начинается из одной клетки, утратившей зависимость деления от защитных механизмов организма-

- в такой клетке возникают изменения генов, что вызывает бесконтрольное ее деление с образованием из нее клона клеток – рак-

- особенность лечения человека от рака в том, что эффект лечения возможен лишь до образования его метастазов-

- рак опасен из-за того, что отдельные его клетки отрываются от клона и, продолжая делиться, проникают в окружающие здоровые ткани, а другие образуют метастазы в отдаленных органах. Это причина гибели людей от рака-

- ПЦР позволяет в биологических жидкостях от больного выявлять самые начальные изменения в структуре ДНК клеток, а в сущности предрак-

- с помощью ПЦР удается в жидкостях обнаружить даже одну дефектную или мутантную молекулу ДНК из раковых клеток среди многих других молекул в исследуемой жидкости- чувствительность этого метода до 100%.

- ПЦР – это универсальный метод для ранней диагностики раковых клеток любой локализации рака у пациента. Им можно выявить тех лиц, которых необходимо обследовать детально.

Проф. А.С. Белохвостов (2000) впервые в двух работах изложил основы ранней диагностике раковых клеток с помощью ПЦР-метода- мы излагаем их кратко:

1) бессимптомный рост рака от одной клетки до очага в 2 мм в ткани продолжается долгие годы или даже десятилетия-

2) такой очаг из раковых клеток до 2 мм в диаметре дремлет в тканях до тех пор, пока не произойдут изменения в генах его клеток, вызывающих ангиогенез и лимфангиогенез. С этого момента начинается рост и распространение его клеток через кровь и лимфу по организму пациента – рак становится болезнью всего организма.

3) еще недавно диагностировать рак размером 2 мм, особенно если он находился во внутренних органах, было почти не возможным. И только метод ПЦР позволил определять очень малое число дефектных генов, иногда даже одну молекулу дефектного гена из раковой клетки.

Раковые клетки содержат эпимутации основных свойств и мутации или эпимутации генов-супрессоров. Такие изменения являются генетической меткой, т.е. маркером раковой клетки.

Ген-супрессор белка р53. В норме он сдерживает деление «генетически дефектных клеток и заставляет их запускать апоптоз».

Мутации в этом гене обнаруживаются в половине случаев раковой клетки разного типа- эти поломки в гене «позволяют генетически дефектной клетке избежать апоптоза».

Ген-супрессор белка p16. Он в норме подавляет деление дефектной клетки «в другой точке клеточного цикла», но инактивирован из-за метилирования его промотора почти у половины раковых клеток разного типа.

Ген k-ras – мутантная форма одного из ключевых нормальных генов стимуляторов деления клетки. Есть еще ряд генов с высокой частотой дефектов в раковой клетке. Для ранней диагностики раковой клетки важна регистрация эпимутаций и мутаций в нескольких генах.

ДНК из раковых клеток попадает «в межклеточную жидкость и далее в кровоток» после разрушения раковых клеток в тканях.

В плазме крови у таких пациентов будут, пишет автор, находиться фрагменты ДНК из раковых клеток. Обнаружить их долго не удавалось, пока не появился ПЦР-метод.

По расчетам проф. А.С. Белохвостова и первый его опыт применения этого метода показал возможность диагностировать в любой ткани рак размером с 2-х мм в диаметре.

Автор подчеркивает, что диагностика раковых клеток в организме паци-по их генам-маркерам в плазме крови ПЦР-методом, позволяет осуществлять слежение за эффектом лечения рака. Он рекомендует сроки взятия для этого плазмы крови: до операции, после операции иссечения рака и путей лимфооттока, а также спустя не ранее, чем через 2 недели после лечения, и после химиотерапии.

Если, маркер, например ген белка р53, выявлен в клетках и в плазме до операции и/или после окончания химиотерапии, это означает, что раковых клеток «или совсем не осталось в организме или их незначительная часть находится в покоящемся состоянии». В любом случае, рецидив или метастазы в ближайшие месяцы маловероятны.

«Если же мутантный ген или измененный в экспрессии ген продолжает выявляться в ДНК плазмы крови или его количество нарастает, это указывает на рецидив рака или метастазы. Это требует изменения схемы лечения – добавления или замены химиопрепаратов, средств биотерапии и т.д.». Такие анализы ученый рекомендует выполнить несколько дней, а «значение ответа – ценою в жизнь».

Мы видим, что ученые сконцентрировали свое внимание на поиске в плазме и других биологических жидкостях генов-маркеров из ядер раковых клеток, а это нелегкая задача (В.П. Шелепов и соавт., 1997).

Оказалось, что мутации могут быть и в митохондриях – органеллах, расположенных в цитоплазме клетки и обнаружить их в раковых клетках достаточно просто. Это открытие сделано проф. Д. Сидрански (2000).

Гены, превращающие нормальную клетку в раковую клетку, часто находятся в ядре клетки в виде одной или многих копий. Но, оказалось, что дефекты и изменения могут возникать не только в них, но и в генах митохондрий раковой клетки.

В каждой клетке, в том числе и раковой, имеется несколько сот митохондрий. Митохондрии – это самореплицирующиеся органеллы.

В каждой из них есть своя ДНК, в ней несколько генов, обеспечивающих синтез белков митохондрий. Количество копий такой ДНК может быть от од-до десяти на митохондрию.

Гены ДНК митохондрий в раковых клетках подвергаются «усиленному воздействию токсических продуктов кислорода». Это вызывает «накопление большого числа изменений в генах митохондрий, чем в генах ядра раковой клетки».

В результате мутации ряда генов митохондрий выявляются в более чем половине случаев раковой клетки разного типа.

Другой важной особенностью в раковой клетке является «вытеснение митохондрий с нормальными генами путем преимущественного размножения митохондрий с мутантной ДНК». Это приводит к тому, что «все митохондрии в раковой клетке становятся потомками митохондрий с мутантными генами ее ДНК».

Отсюда: если «в гене, находящемся в ДНК ядра клетки может быть лишь одна или две копии мутантного гена, то в митохондриях одной раковой клетки может находиться от нескольких сотен до десяти тысяч копий мутантного гена митохондриальной ДНК».

Из этого, проф. А.С. Белохвостов (2000) делает вывод: «если раковые клетки обнаруживать по мутантным генам митохондрий в плазме крови и в других биологических средах пациента, чувствительность ПЦР-теста можно увеличивать еще в сотни раз по сравнению с применяемым сейчас методом выявления маркеров измененных генов из ДНК ядра раковой клетки».

Сейчас, пишет проф. А.С. Белохвостов, возможным пределом размера обнаруживаемого рака считается очаг в 2-3 мм в диаметре, то при применении ПЦР для поиска в плазме крови мутантных генов митохондриальной ДНК, из раковых клеток, по-видимому, можно будет определять очаг рака в ткани в 1 мм в диаметре.

В случае успеха такого подхода к оценке генов-маркеров раковых клеток ядерного генеза будут добавлены гены-маркеры из ДНК митохондрий раковых клеток.

О повышении выявляемости раковых клеток автор дает пояснения. Он говорит, что «мутации какого-либо гена раковой клетки, взятого в качестве маркера, встречаются только у части пациентов».

Изменения в экспрессии генов свойств нормальной клетки – главная причина канцерогенеза.

Метилирование CpG-островков в промоторе гена выключает ген, а деметилирование – включает ген. При этом изменений структуры в последовательности оснований гена не происходит. Это обозначают термином – эпимутация, о чем мы уже писали в разделе канцерогенеза.

Метилирование или деметилирование промотора генов – это маркеры раковой клетки. Для анализа статуса метилирования генов раковой клетки часто используют МС-ПЦР – метилспецифическая полимеразная цепная реакция. Материалом для этого является ДНК раковых клеток в образцах плазмы крови и других биологических жидкостей, фрагменты из опухоли от пациента.

Диагностика раковых клеток по их эпигенетическим изменениям в сравнении с нормальной клеткой – это новое направление в ранней диагностике раковых клеток. Оно открывает новые пути для создания новых лекарственных средств и методов лечения от рака.

В целях изучения канцерогенеза и других проблем ученые используя методы – ПЦР-ММК, МС-ПЦР, микрочипы и др. занялись изучением профилей экспрессии «изолированных клеток и клеточных культур».

1. Фенотип стволовой клетки. Цель – знать типичный профиль экспрессии генов в эмбриональных и региональных стволовых клетках. Оказалось, что в этих клетках набор экспрессируемых генов «ограничен». Это важно для понимания явления «стволовости».

2. Сравнение экспрессии генов в эмбриональных стволовых и раковых клетках. Обнаружено, что многие раковые клетки экспрессируют белки-маркеры эмбриональных стволовых клеток. Например, Oct-4, Nanog и hTERT, что указывает на сходство биологии эмбриональных стволовых «и, по крайней мере, части раковых клеток».

3. Сравнение профилей экспрессии региональных стволовых и раковых клеток. Профиль экспрессии некоторых типов раковой клетки сходен с профилем экспрессии региональных стволовых клеток той ткани, из которой возникает раковая клетка, это указывает на то, что «именно региональные стволовые клетки в этих тканях способны претерпевать злокачественное перерождение» (К.Н. Ярыгин, Е.Е. Егоров, И.Б. Чеглаков и соавт., 2006).<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!