Поиск cpg-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки

Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-

богатыми праймерами. Задачей нашего исследования было обнаружение CpG-островков, метилированных в опухолях шейки матки. Для ее решения мы использовали метод метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами (СП-ПЦР) (Gonsalgo et al. 1997). Принцип метода заключается в следующем. ДНК из двух сравниваемых образцов (в нашем случае из опухолевой ткани и лейкоцитов или прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани, взятых

от одного и того же пациента) обрабатывали мелкощепящей рестрикционной эндонуклеазой (рис. 5А), в

<- 3`-GCGCCCAATCCCACTCCCAA-5` Рисунок

5. Схематическое изображение метода метил-чувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

. Кружком обозначен сайт МЧР: О - сайт не метилирован, ф - сайт метилирован. А. Схема эксперимента- Y - статистический GC-богатый праймер. Б. Присоединение статистического праймера к CpG-богатому району ДНК. Вертикальными черточками обозначены CpG динуклеотиды. Стрелки указывают направление синтеза ДНК.

сайте узнавания которой нет CpG динуклеотидов. Мы в своей работе использовали ферменты Rsal и Msel. Их применение позволяет получить CpG-островки в составе сравнительно небольших фрагментов геномной ДНК. Это повышает вероятность последующей амплификации CpG-островков, так как небольшие GC-богатые фрагменты ДНК амплифицируются лучше, чем крупные. В тоже время большинство CpG-островков остаются после обработки такими рестриктазами неповрежденными. Затем обработанную ДНК снова подвергали рестрикции, но уже с использованием так называемых метилчувствительных рестриктаз (МЧР), отличительной чертой которых является два свойства. Во-первых, такие ферменты имеют в составе своих сайтов рестрикции один и более CpG динуклеотидов, поэтому CpG-островки содержат повышенное количество сайтов этих рестриктаз по сравнению с остальной ДНК. Во-вторых, МЧР работают в зависимости от статуса метилирования определенного CpG динуклеотида в сайте рестрикции. Так, они не способны рестрицировать свой сайт, если цитозин в составе этого CpG динуклеотида метилирован. Именно это свойство МЧР позволяет проводить дифференциальный анализ статуса метилирования CpG-островка. Таким образом, использование МЧР с одной стороны повышает вероятность обнаружения именно CpG-островка, а с другой определить его статус метилирования.

Далее все варианты обработанных рестриктазами ДНК из опухолевой и нормальной ткани амплифицировали с использованием статистических GC-богатых праймеров. Эти праймеры представляют собой олигонуклеотиды, подобранные к среднестатистической последовательности ДНК, за исключением 3` конца, который состоит из 5-6 остатков цитозина и гуанина в различной комбинации (обычно расположенных случайным образом, но могут представлять собой и последовательность сайта какой-нибудь МЧР, например SacII в праймере СП-2). Наличие такого 3` конца приводит к тому, что в неспецифических условиях (при достаточно низких температурах отжига) происходит предпочтительная гибридизация праймера с GC-

богатыми областями ДНК (рис. 5Б). Так достигают обогащения продуктов ПЦР фракцией GC-богатых последовательностей, включающей также и CpG-островки.

После амплификации ПЦР продукты разделяли в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для детекции продуктов мы использовали два метода. Первый является стандартным и подразумевает применение

33

меченого нуклеотида при проведении ПЦР. Мы использовали a- P-dATP. В дальнейшем, после разделения, продукты выявляли, экспонируя гель с рентгеновской пленкой. Альтернативным методом идентификации является серебрение фрагментов ДНК непосредственно в полиакриламидном геле (реакция серебряного зеркала). Несмотря на более низкую чувствительность по сравнению с первым методом, он позволяет эффективно выявлять относительно длинные продукты реакции (300-1000 п.н.). На рисунке 6

Рисунок 6.

Сравнение двух методов визуализации продуктов ПЦР в ПААГе

. А. Радиоавтограф ПААГ с радиоактивномеченными продуктами ПЦР. Б. Серебрение фрагментов ДНК непосредственно в ПААГе. Стрелкой указан фрагмент, взятый в дальнейшее исследование. Числа вверху рисунка обозначают номера образцов, где Л -ДНК из лейкоцитов, О - ДНК из опухоли шейки матки. Рестрикция образцов ДНК MseI (M)- MseI/HpaII/HhaI (H).

представлены результаты типичного опыта по сравнению двух способов визуализации продуктов ПЦР в полиакриламидном геле. Стрелкой указан один и тот же фрагмент, выявленный как серебрением, так и при помощи радиоактивной метки. Таким образом, метод серебрения позволял нам надежно идентифицировать фрагменты ДНК в диапазоне от 300 до 1000 н.п., что, согласно общепринятым критериям (Gardiner-Gardner and Frommer 1987), соответствует размерам CpG-островков. В случае продуктов короче 300 п. н. радиоизотопный метод более чувствителен, чем серебрение.

Основными преимуществами метода СП-ПЦР являются простота выполнения и относительная дешевизна. К главным недостаткам метода следует отнести тот факт, что он обнаруживает GC-богатые последовательности, не все из которых представляют собой CpG-островки. Причиной этому служат праймеры, которые не могут дифференцировать CpG-островки и амплифицируют все GC-богатые последовательности. Поэтому нами были внесены модификации, повышающие вероятность обнаружения CpG-островков. Известно, что скопление сайтов редкощепящих МЧР указывает на присутствие CpG-островка (Bird 1986). В связи с этим использование одновременно нескольких крупнощепящих ферментов метилчувствительной рестрикции повышает вероятность идентификации CpG-островка. Поэтому, наряду с обычно применяемыми мелкощепящими метилчувствительными эндонуклеазами (HpaII, Hhal) мы использовали крупнощепящие ферменты (SmaI, SacII, NarI). При этом недостатком использования МЧР является возможность неполного расщепления сайта рестрикции. Хотя для решения этой проблемы мы применяли двухэтапную обработку ДНК МЧР (см. раздел "Материалы и методы", п. 5), подтверждение статуса метилирования выявленных фрагментов требует дополнительных исследований.

Обычно при сравнительном анализе ДНК из опухолевых и нормальных клеток методом МЧ-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами в геле присутствуют три типа продуктов ПЦР (рис. 7).

Первый тип продуктов присутствует в ДНК, как нормальных тканей, так и опухолей независимо от того, обработана ли ДНК метилчувствительными ферментами или нет. В этом случае возможны два варианта. Либо амплифицируемые фрагменты ДНК не содержат сайтов метилчувствительных рестриктаз, или же эти сайты присутствуют, но

метилированы во всех исследуемых ДНК. Такие продукты ПЦР встречаются наиболее часто. Второй тип продуктов присутствует в ДНК, необработанных метилчувствительными рестриктазами, и отсутствует в ДНК, обработанных ими, независимо от того из опухолей или нормальной ткани они выделены.

Такое состояние объясняется тем, что в амплифицируемых последовательностях есть неметилированные сайты узнавания, которые расщепляются рестриктазами, и, следовательно, предотвращается появление продуктов ПЦР. Эти последовательности наиболее вероятные кандидаты на роль CpG-островков. Они встречаются гораздо реже продуктов первого типа. И, наконец, существует третий тип продуктов, отсутствующий в ДНК из нормальных клеток и присутствующий в ДНК из некоторых опухолей.

Причем данное различие существует только для ДНК, обработанных метилчувствительными рестриктазами. В этом случае сайты узнавания в амплифицируемых последовательностях есть, но они метилированы в некоторых опухолях в отличие от нормальных тканей. Такие продукты ПЦР встречаются еще реже,но поскольку они имеют исключительное метилирование только в опухоли, эти фрагменты, в сущности, и являются предметом поиска и дальнейших исследований.

I. II. III.

Рисунок 7.

Схема типов продуктов ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, встречающиеся в ПААГе

. МЧР - метилчувствительная рестриктаза- Н -прилегающая нормальная ткань, О - опухоль. Кружком обозначен сайт МЧР: О - сайт не метилирован, ф - сайт метилирован.

Типичный результат сравнительного анализа ДНК из опухолевых и нормальных клеток методом МЧ-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами представлен на рисунке 8. Здесь видно, что большинство четко

идентифицируемых фрагментов располагается в районе от 300 до 800 п.н. и являются продуктами первого и второго типа (отмечены стрелками). Также можно заметить, что продукты первого типа встречаются чаще, чем второго.

Примеры продуктов третьего типа представлены на рисунке 9.

234 235 243 2500 275 289

-200 ни

Н О Н О Н О Н О Н О Н О R N R N R N R N R N R N R N R N R N R N R N R N

Рисунок 8.

Анализ продуктов амплификации ДНК из опухолевых и нормальных клеток с помощью СП-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами СП-2 и СП-3

. Фотография геля с продуктами ПЦР, окрашенных серебрением. Числами вверху рисунка обозначены номера образцов, где Н - ДНК из нормального эпителия- О - ДНК из опухоли шейки матки. Рестрикция образцов ДНК RsaI (R)- RsaI/NarI (N). Стрелками указаны: i=> -продукт ПЦР первого типа- - продукт ПЦР второго типа. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

ферментами, содержащимися в полилинкере. Вслед за этим проводили сиквенс клонов.

После секвинирования был проведен анализ полученных последовательностей. Во-первых, исследуемые фрагменты локализовывали в геноме человека. При отрицательном результате поиск проводили в геномах других позвоночных. Для решения этой задачи мы использовали набор программ поиска гомологий BLAST® (см. раздел "Материалы и методы", п. 14.1). Во-вторых, необходимо было установить, является ли обнаруженная нами последовательность CpG-островком. Для этого мы использовали общепринятые критерии CpG-островков (см. раздел "Материалы и методы", п. 14.2).

Результаты анализа выявленных фрагментов представлены на рисунке 10 и в таблице 4.

Фрагмент 18 локализован во втором интроне гена LOC148870, расположенного на первой хромосоме в зоне 1p36.32 (Homo sapiens chromosome 1 reference genomic contig NT 004321, ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/viewer.fcgi?val=NT_004321.12). Данный ген получен автоматическим компьютерным анализом с использованием метода предсказания BLAST. Подтверждением наличия гена служит существование гомологии с последовательностью одного клона EST. Ген имеет продукт -гипотетический белок FLJ32825, функция которого неизвестна. По GC составу и показателю Н/Т этот фрагмент принадлежит к GC-богатым последовательностям и не является CpG-островком.

Фрагмент 30 расположен в локусе AL137850 девятой хромосомы в зоне 9q31.3-33.3 (Homo sapiens chromosome 9 reference genomic contig NT_017568, ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NT_017568.10). Данный фрагмент также представляет собой просто GC-богатую последовательность.

Фрагмент 22. В базах данных не обнаружено последовательности гомологичной этому фрагменту. При этом анализ указывает на его

* Идентификационный номер в GenBank: 22 - AF218212, 26 - AF247736

** В случае фрагментов 26, 32, 34 и 36 данный показатель приведен для всего CpG островка

*** Полный размер CpG островка указан на основании гомологии в случае фрагмента 34 с геном LOC254722, в случае фрагмента 36 с 3.3-kb повтором, в случае фрагмента 26 после определения нуклеотидной последовательности 5` регуляторного района гена вЗА-адаптина

принадлежность к CpG-островку. Обращает на себя внимание, что из всех выявленных нами CpG-островков фрагмент 22 обладает наиболее высокой плотностью CpG динуклеотидов (63 на 563 п.н.).

Фрагмент 32 расположен в локусе AL137058 на тринадцатой хромосоме в зоне 13q32.2-33.3 (Homo sapiens chromosome 13 reference genomic contig NT 024524, ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val= NT 024524.10). Данная последовательность окружена с двух сторон повторами MER21B - 5` и AluSx - 3`, а сам фрагмент гомологичен CpG-островку, который в свою очередь был выявлен с помощью компьютерного анализа (Sanger Centre Chromosome 13 Mapping Group, https://sanger.ac.uk/HGP/Chr13), однако ген, ассоциированный с этим CpG-островком, не определен.

Фрагмент 34 был выявлен при клонировании фрагмента 32, по-видимому, в качестве незначительной примеси, неотделившейся даже в денатурирующих условиях при электрофорезе в ПААГе, предположительно за счет высокого содержания GC пар в обоих фрагментах. Местоположение фрагмента 34 в геноме - 3` область гена LOC254722, расположенного на хромосоме Х (Homo sapiens chromosome X reference genomic contig NT 011786, ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?val=NT_011786.10), полученного компьютерным анализом с использованием метода предсказания GenomeScan. Существование данного гена подтверждается гомологией с одним клоном EST. Фрагмент 34 содержит в своем составе часть последовательности CpG-островка, который включает в себя конец последнего интрона, последний экзон гена и нетранскрибируемую межгенную последовательность.

Фрагмент 36. При анализе нуклеотидной последовательности этого фрагмента было установлено, что он гомологичен близкородственным друг другу областям с тандемными 3.3-kb повторами, располагающимся в прителомерных областях хромосомы 10 (зона 10q26.3) и хромосомы 4 (зона 4q35, полиморфный район D4Z4). Так в локусе D4Z4 обнаруживают от 10 до

100 тандемных 3.3-kb повторов. Каждая копия повтора содержит ген DUX4, относящийся к семейству генов DUX, кодирующих транскрипционные факторы с двумя гомеодоменами (Gabriels et al. 1999). Для локуса 10q26.3 хромосомы 10 на данный момент выявлен набор гипотетических генов, имеющих предсказанную компьютерным анализом пептидную структуру, подобную гомеобоксным белкам. По своим параметрам 3.3-kb повтор обладает свойствами CpG-островка (Access. No HUMFSHD https://ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&lis t_uids=00871846&dopt=GenBank) и принадлежит к семейству 3.3-kb повторов, ассоциированному с областями гетерохроматина. Кроме прителомерных областей хромосом 4 и 10 члены этого семейства располагаются на коротком плече всех акроцентричных хромосом и в перицентромерной области хромосомы 1 (см. van Geel et al. 2002).

Фрагмент 26. При поиске гомологий с известными последовательностями выяснилось, что первые 127 н.п. (фрагмент А, рис. 11) имеют гомологию с 5` концом кДНК гена вЗА-адаптина (AP3B1: adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit). Следующие 93 н.п. (фрагмент Б) не имели гомологий с известной последовательностью, а последние 45 н.п.



1 экзон 1 интрон 2 экзон

H Sc H N Sc H

CpG островок -4—26-3 100 п.н.

Рисунок 11.

Схематическое изображение расположения относительно друг друга первого экзона гена

вЗА-адаптина, фрагмента 26 и ранее обнаруженного CpG островка (Cross et. al., 1994). Вертикальная черта обозначает местоположение сайтов метилчувствительныхрестриктаз:H-HpaII-Sc-ScaII-N-Narl-

- фрагмент А,ЕЭ - фрагмент Б,ЕЭ - фрагмент В, — - неизвестная последовательность. Стрелками обозначены праймеры.

(фрагмент В) перекрываются с последовательностью, которая ранее была обнаружена другим методом как CpG-островок (Cross et al. 1994).

Нахождение фрагмента 26 и этого CpG-островка в составе единой последовательности мы подтвердили получением общего продукта амплификации ДНК из клеток HeLa с помощью праймеров 26-1 и 26-3 и его последующим секвенированием. Так как на тот момент была известна только кДНК этого гена, и отсутствовал полный сиквенс ДНК этого района, из полученных результатов следовало, что фрагмент А является частью первого экзона, а фрагмент Б и ранее обнаруженный CpG-островок представляют собой начало первого интрона. Сопоставление нуклеотидных последовательностей выделенного нами фрагмента ДНК и кДНК гена показало, что в состав первого экзона входят 220 н.п., далее следует канонический донорный сайт сплайсинга (GT), а следующие 362 н.п. не имеют гомологии с последовательность кДНК и представляют начало первого интрона. После появления и аннотирования в базах данных полной последовательности ДНК гена (Homo sapiens chromosome 5 reference genomic

contig NT_006713,

https://ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NT_006713.10) оказалось, что размер первого экзона действительно составляет 220 н.п., а первый интрон начинается с установленной нами последовательности и имеет длину 26856 н.п. Таким образом, установленные нами границы первого экзона и опубликованные позднее данные по аннотированию генома человека совпали.

Несмотря на небольшую длину, фрагмент 26 обладает свойствами CpG-островка (значение Н/Т составляет 0.78, содержание GC равно 0.59). Также он оказался ограничен с обеих сторон сайтом SacII. Данный фрагмент был выявлен с помощью статистического праймера СП-2, который имеет на 3` конце последовательность сайта SacII. Действительно, в 5` области гена вЗА-адаптина имеется зона, где два сайта SacII расположены на расстоянии 275 п.н., и именно эта зона и была амплифицирована. С другой стороны анализ показал, что CpG-островок не ограничен рамками фрагмента 26. Из исследований параметра Н/Т и GC-состава следует, что в его состав входят весь первый экзон и начало первого интрона. С 3` конца он ограничен повтором HERVK14CI. На основании этого можно сделать вывод, что CpG-островок гена вЗА-адаптина заканчивается в первом интроне. Из-за отсутствия полной последовательности ДНК гена вЗА-адаптина невозможно было определить, продолжается ли CpG-островок в 5` регуляторную зону. Это было сделано экспериментально (см. ниже).

Таким образом, все семь фрагментов ДНК, выявленных методом СП-ПЦР, оказались GC-богатыми последовательностями, а пять из них CpG-островками. При этом они являются CpG-островками, не только по общепринятым критериям, но и по предложенным в последнее время критериям, которые позволяют исключить GC-богатые Alu-повторы: размер последовательности более 500 н.п., GC состав более 0.55, отношение экспериментально определенного числа CpG динуклеотидов к теоретически возможному (показатель Н/Т) более 0.65 (Takai and Jones, 2002). Обращает на себя внимание тот факт, что среди пяти отобранных CpG-островков не оказалось последовательностей, ассоциированных с Alu-повторами, эндогенными провирусами и рибосомальными генами. Возможно, что отсутствие такого типа CpG-островков связано с непременным условием отбирать только те CpG-островки, которые изменяли статус метилирования в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Отбор дифференциально-метилированных CpG-островков проводили на небольшом числе парных образцов (группы из 7 и 8 пар образцов). Анализ реального статуса метилирования в относительно большом числе опухолей и двух клеточных линиях карцином шейки матки был проведен для CpG-островков 32 и 26.

Определение статуса метилирования CpG-островка З2 при раке шейки матки.

Анализ статуса метилирования CpG-островка 32 был проведен в 22 образцах опухолей шейки матки, 15 нормальных тканей шейки матки и 7 лейкоцитов периферической крови тех же пациентов, и в двух клеточных линиях карцином шейки матки методом метил-чувствительной ПЦР.

Использовали два варианта анализа: одновременное расщепление четырех (1 сайт NarI и 3 сайта HpaII) или шести (3 сайт HpaII и 3 сайта HhaI) сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз в участке CpG-островка,который затем подвергался амплификации. В большинстве опухолей,лейкоцитов и условно нормальных тканях и в двух клеточных линий после

обработки метилчувствительными рестриктазами присутствовал продукт

271Л 271О 275Л 275О HeLa SiHa R RNH RRNH R RNH R RNH R RHHh R RHHh M

451Н 451О 456Н456ОR RHHh R RHHh R RHHh R RHHh М_ _.._ Щи ^m ^m m* -HULL

-300ul

Рисунок 12.

Анализ статуса метилирования CpG динуклеотидов

, входящих в состав сайтов рестрикции метилчувствительных ферментов NarI, HpaII и HhaI в пределах CpG островка 32 методом МЧ-ПЦР. Рестрикция образцов ДНК RsaI (R)- RsaI/NarI/HpaII (RNH)- RsaI/HpaII/HhaI (RHHh). Числами вверху указаны номера образцов, где Л - ДНК из лейкоцитов, Н - ДНК из нормального эпителия, О - ДНК из опухоли шейки матки- М -маркер 100 bp, числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

амплификации, что говорит о метилировании всех исследуемых сайтов (рис. 12, образцы 271, 451, 456, клетки HeLa и SiHa). В одном из 22 образцов продукт ПЦР отсутствовал (рис. 12, образец 275). Наличие метилированных аллелей исследуемого CpG-островка в большинстве лейкоцитов, опухолевых и нормальных тканях шейки матки дает основание предполагать, что CpG-островок 32 может быть расположен в подверженном импринтингу локусе хромосомы 13. Как известно, импринтинг гена сопровождается метилированием CpG-островка в одном из аллелей гена и моноаллельной экспрессией гена в нормальных клетках. Для опухолевых клеток характерна утрата импринтинга, сопровождающаяся изменением статуса метилирования CpG-островка врайонеимпринтированногогена инарушением

моноаллельной экспрессии гена. Недавно было обнаружено, что потеря импринтинга гена IGF-II наблюдается не только в опухолях кишечника, но и в нормальных тканях (лейкоцитах) этих же пациентов (Cui et al. 1998). Возможно, что отсутствие метилирования CpG-островка 32 у пациента 275 в опухолевой ткани и в лейкоцитах периферической крови связано с утратой импринтинга.

Таким образом, CpG-островок 32 действительно дифференциально метилирован в некоторых опухолевых и нормальных тканях. Предположение о том, что CpG-островок 32 локализован в подверженном импринтингу районе хромосомы 13, указывает на необходимость соответствующего детального исследования этого района в дальнейшем. К сожалению CpG-островок 32 пока не ассоциирован с каким-либо геном. В этом районе пока не обнаружено рамок считывания, подтвержденных наличием EST.

Определение полного размера CpG-островка гена /ЗА-адаптина. Для последующего исследования мы выбрали CpG-островок гена вЗА-адаптина, так как он оказался единственным выявленным CpG-островком, ассоциированным с известным геном. В связи с этим возникла задача установить полную длину CpG-островка. Так как 3` конец CpG-островка был известен, нам необходимо было определить его границу в 5` области гена. Для этого мы использовали один из вариантов метода "прогулки по геному". Схема опыта представлена на рисунке 13А. Первоначально геномную ДНК обрабатывали с помощью рестриктазы, образующей "липкие" концы. При этом был выбран фермент TaqI, не имеющий сайта рестрикции в известной последовательность. После этого полученные фрагменты лигировали в концентрации, при которой они предпочтительно образуют кольцевые структуры (данный этап работы был проведен сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Ешилевым Э.М., который любезно предоставил материал для клонирования). Далее полученные фрагменты ДНК, замкнутые в кольцо, амплифицировали с помощью так называемых инвертированных праймеров. Данные праймеры были подобраны к известной последовательности, однако они ориентированы в противоположные стороны. При использовании в качестве матрицы линейной ДНК такие праймеры продукта не дают, а при амплификации кольцевой молекулы образуют продукт, который содержит в своем составе следующие части: праймер 1-5` известная последовательность - 5` неизвестная последовательность - сайт рестрикции TaqI - 3` неизвестная последовательность - 3` известная последовательность - праймер 2. После этого проводили клонирование продукта ПЦР с последующим секвенированием в составе плазмиды.

А. ДНК

Клонирование и секвенирование продукта ПЦР



Б.

26-11 > >26-5

I -

-426-12 -426-10 -426-8 426-2

Рисунок 13.

Схематическое изображение варианта метода "прогулка по геному".

А. Схема опыта- EZI - известная последовательность, ¦ ¦ ¦ ¦ - неизвестная последовательность, > - праймер. Б. Расположение использованных для клонирования праймеров к известной последовательности 5` области гена /ЗА-адаптина.

Для получения и исследования неизвестной 5` области гена мы применяли гнездовую ПЦР с использованием двух пар инвертированных праймеров (рис. 13Б). Первоначально кольцевую ДНК амплифицировали с использованием праймеров 26-11 и 26-8. Затем проводили второй раунд ПЦР, где применяли праймеры 26-5 и 26-10. При этом в качестве матрицы использовали реакционную смесь после первого ПЦР, как в неразведенном виде, так и в разведении 1:10. На рисунке 14А представлены результаты

Рисунок 14.

Анализ фрагментов ДНК, полученных с помощью инвертированных праймеров к гену рЗА-адаптину

. А. Результат электрофореза в агарозном геле продуктов второго раунда ПЦР- М - маркер X PstI. Б. Гибридизация продуктов второго раунда ПЦР с радиоактивномеченным праймером 26-2. Разведение матрицы - продукта первого раунда ПЦР: 1 - неразведенный, 2 - разведение 1:10. Стрелкой указан исследуемый фрагмент. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации после второго раунда ПЦР. Видно, что в геле присутствовало несколько полос. Для выявления продукта ПЦР, содержащего необходимую нам последовательность, мы переносили амплификаты на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с радиоактивно-меченным праймером 26-2, последовательность которого должна присутствовать в продукте ПЦР, содержащем известную область гена вЗА-адаптина. Результаты гибридизации показаны на рисунке 14Б. Оказалось, что продукт с размером 1966 п.н. и является искомым. Он был клонирован и секвенирован.

Рисунок 15.

Расположение вновь клонированного фрагмента в 5` области гена

/ЗА-адаптина по отношению к ранее известным районам. А. Рестриктная карта 5` области гена. Вертикальная черта обозначает местоположение сайтов метилчувствительных рестриктаз: H - HpaII- Hh - Hhal- Sm - Smal- Sc - Scall- N - Narl. Б. Распределение CpG

динуклеотидов и расположение CpG островка. — - CpG островок, ? - повтор, И -экзон, ЕЕ - интрон, ЕЕ - вновь клонированная последовательность. Вертикальная черта

обозначает единичный CpG динуклеотид.

В результате этой работы мы определили 5` нетранскрибируюмую последовательность гена (ЗЗА-адаптина размером 597 п.н. Анализ объединенной последовательности 5` области гена (идентификационный номер в GenBank - AF247736.2) позволил определить размер его CpG-островка, который составил 868 п.н. (рис. 15). Он включает в себя 56 CpG динуклеотидов и имеет следующие характеристики: значение параметра Н/Т равно 0.74, GC состав - 0.60. Наибольшая плотность CpG динуклеотидов (24 из 56) и сайтов МЧР (13 из 20) наблюдается в 5` нетранскрибируемой зоне размером 238 п.н., непосредственно примыкающей к первому экзону. Наличие и положение Alu-повтора, ограничивающего CpG-островок с 5` стороны, было определено по представленной позднее в базах данных нуклеотидной последовательности этого района хромосомы 5.

Таким образом, мы установили полный размер и последовательность CpG-островка гена /ЗЗА-адаптина, который располагается в 5` области гена и включает в себя нетранскрибируемый район, первый экзон и начало первого интрона. При этом он является CpG-островком, как по общепринятым критериям, так и по более жестким критериям (см. выше).<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!