Гель-электрофорез

Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.

Разделение ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле в 1 ТАЕ в присутствии бромистого этидия. Геномную ДНК после обработки метил-чувствительными рестриктазами и плазмидную ДНК фракционировали в 0.8% агарозе- фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, в зависимости от размера разделяли в 1-3% геле. Соответствующее количество агарозы("Sigma", США- "Serva", США) и буфера ТАЕ нагревали в дистиллированной воде до полного расплавления агарозы. После этого раствор агарозы охлаждали до 50оС и добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0.5 мкг/мл, перемешивали и заливали в кювету для геля.Образцы исследуемой и маркерной ДНК наносили в гель, предварительно смешав с буфером для нанесения (9:1, о/о). В качестве ДНК-маркера применяли X Hind III, X PstI и 100bp (табл. 3). Электрофорез геномной ДНК проводили при напряженности электрического поля

Таблица 3.

ДНК-маркеры молекулярного веса

.

3-4 В/см в течение ночи. В дальнейшем фракционированную геномную ДНК переносили на нейлоновую мембрану и использовали в блот-гибридизации. Электрофорез плазмидной ДНК и продуктов ПЦР проводили при напряженности электрического поля 10-15 В/см в течение 30-45 мин. ДНК в геле регистрировали по флуоресценции в проходящем ультрафиолете с длиной волн от 240 нм до 360 нм. Результаты протоколировали с помощью фотографирования геля или системы Gel Imagertm.

Электрофоретическоеразделение РНК в агарозном геле. Разделение РНК проводили в горизонтальном 0.8% агарозном геле в 2 BE в присутствии формальдегида и бромистого этидия. Для получения геля соответствующее количество агарозы ("Sigma", США) и буфера ВЕ нагревали в небольшом количестве дистиллированной воды до полного расплавления агарозы. Затем добавляли 1/6 конечного объема 37% раствора

формальдегида, бромистый этидий до конечной концентрации 0.2 мкг/мл и дистиллированную воду, перемешивали и заливали в кювету для геля. Перед нанесением образцы исследуемой РНК переосаждали с использованием 3М ацетата натрия - 96% этанола (см. п. 13) и растворяли в 20 мкл смеси, содержащей 50% формамид, 2 BE буфер, 7% формальдегид и бидистиллированную воду. Затем пробы инкубировали при 55оС в течение 15 мин, охлаждали в ледяной бане в течение 5 мин и наносили в гель, предварительно смешав с буфером для нанесения (9:1, о/о). Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 3-4 В/см в течение 3-4 ч. Результаты протоколировали с помощью фотографирования геля. В дальнейшем фракционированную РНК переносили на нитроцеллюлозную мембрану и использовали в блот-гибридизации.

Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем

полиакриламидном геле.

Для проведения электрофореза в ПААГе мы использовали электрофоретический прибор Sequi-Gen ("Bio-Rad", США). В качестве электрофоретического буфера использовали 1 ТВЕ.

Для связывания геля со стеклом, одно из стекол обрабатывали "кислым" силаном (acid activated silane). Другое стекло силиконизировали диметилхлорсиланом (repel silane). Для получения геля готовили 75 мл

смеси, следующего состава: 9.375 мл 40% раствора акриламид-бисакриламид

х

(соотношение акриламид-бисакриламид 19:1), 15 мл 5 ТВЕ, 31.5 г мочевины и дистиллированная вода до необходимого объема. Затем добавляли 300 мкл ПСА и 60 мкл TEMED, тщательно перемешивали и заливали в прибор для полимеризации. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при напряженности электрического поля 45 В/см в течение 1 ч.

Пробы для электрофореза в ПААГ готовили следующим образом: 2 мкл исследуемого продукта ПЦР смешивали с 6 мкл буфера для нанесения в ПААГ. Далее пробы прогревали при 100оС в течение 5 мин, охлаждали в ледяной бане, брали аликвоту 4 мкл и наносили на гель. Электрофорез проводили в течение 4-6 ч при 50оС и напряженности электрического поля 40-50 В/см (в зависимости от температуры геля).

По окончании электрофореза гель оставался на стекле, обработанным " кислым" силаном и его фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение 20 мин. После фиксации гель отмывали 3 раза дистиллированной водой по 2 мин каждый раз. Затем проводили окраску раствором 1 для серебрения в течение 30 мин, промывали 20 сек дистиллированной водой и проявляли раствором 2 для серебрения в течение 1-5 мин (до появления окраски ДНК). Затем реакцию останавливали фиксацией в 10% уксусной кислоте в течение 5 мин и промывали водой. Результаты протоколировали с помощью сканера Mustek 1200SP.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!