Бисульфитная модификация днк

Данный метод основан на способности иона гидросульфита, получающегося при растворении бисульфита натрия в воде, взаимодействовать с цитозином в составе одноцепочечной ДНК с превращением последнего в урацил. В тоже время 5-метилцитозин при тех же условиях модификации не подвергается. В дальнейшем производится амплификация исследуемой последовательности ДНК с помощью ПЦР. При этом все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин (Olek et al. 1996).

200 нг геномной ДНК выдерживали 5 мин в кипящей водяной бане, после чего охлаждали во льду. Добавляли раствор NaOH до конечной концентрации 0,3 М и инкубировали при 50оС 15 мин. Затем вносили 2 объема 2% низкоплавкой агарозы ("Sigma", США) и всю смесь переносили в пробирку с холодным минеральным маслом для формирования агарозной " бусины". После этого добавляли раствор Na2S2O3 и гидрохинона до конечной концентрации 3.1 М и 0.5 мМ соответственно и инкубировали при

о Х

50 С 16 ч. Дальше промывали раствором 1 TAE 6 раз по 15 мин. Вслед за тем проводили десульфонацию раствором 0,2 М NaOH 2 раза по 15 мин и промывали первоначально раствором 1 TAE 1 раз 15 мин, а потом бидистиллированой водой 3 раза по 15 мин. Дальше «бусину» разводили нагреванием бидистиллированой водой в 10 раз и аликвоту использовали для

ПЦР.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!