Клонирование продуктов пцр

Вектор.

Для клонирования продуктов ПЦР мы использовали плазмиду pGEM®-T Easy, входящую в состав системы pGEM®-T Easy Vector System ("Promega", США). Так как некоторые термостабильные ДНК-полимеразы, в частности Taq ДНК-полимераза, часто добавляют на 3` конец амлификата одиночный дезоксиаденозин, то вектор pGEM®-T Easy содержит в сайте клонирования на обоих 3` концах исскуствено добавленный одиночный концевой тимидин. Эта модификация позволяет значительно увеличить эффективность лигирования продукта ПЦР и плазмиды, поскольку обеспечивает комплементарность концов продукта ПЦР и плазмиды и снижает вероятность самолигирования вектора. Отбор трансформированных клонов вели по их резистентности к ампицилину, обеспечиваемой вектором pGEM®-T Easy, и с помощью биохимического теста, именуемого бело-голубой селекцией. Несущие рекомбинантные плазмиды бактерии образуют колонии белого цвета, а бактериальные клоны, содержащие только плазмиду, - голубого. Полилинкер фланкируют промоторы T7 и SP6 РНК полимераз, что позволяет проводить определение нуклеотидной последовательности вставки, используя соответствующие праймеры.

Лигирование фрагмента ДНК, полученного в результате ПЦР, с вектором pGEM®-T Easy проводили по методике, предложенной фирмой. Трансформацию компетентных клеток проводили всем количеством полученной рекомбинантной плазмиды.

Получение компетентных клеток Escherichia coli.

Для получения компетентных клеток мы использовали штамм XL1-Blue Escherichia coli и стандартный метод с применением CaCl2 и RbCl (под ред. Гловера 1988).

В 500 мл колбу вносили 50 мл среды SOС и 1 мл ночной культуры бактерий. Наращивали клетки при 37оС с интенсивным перемешиванием до плотности -5-10 клетка/мл, что для данного штамма соответствует оптической плотности D550 = 0.5. После достижения бактериальными клетками необходимой концентрации переносили культуру в полипропиленовые пробирки и охлаждали в ледяной бане в течение 15 мин. Затем осаждали клетки центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 15 мин при 4оС и тщательно удаляли супернатант. Далее ресуспендировали клетки в объеме буфера RF1, составляющем 1/3 от собранного объема, и инкубировали клетки в ледяной бане в течение 15 мин. Осаждали клетки как описано выше. Потом ресуспендировали клетки в буфере RF2 (1/12.5 исходного объема) и инкубировали в ледяной бане в течение 15 мин. После этого суспензию клеток разделяли на аликвоты по 100 мкл в охлажденные 1.5 мл микроцентрифужные пробирки и быстро замораживали в жидком азоте. Компетентные клетки хранили при температуре -70оС.

Трансформация клеток Escherichia coli.

100 мкл суспензии компетентных клеток размораживали в ледяной бане, вносили рекомбинантную ДНК, осторожно перемешивали и оставляли в ледяной бане в течение 30 мин. Затем клетки выдерживали в водяной бане при 42°С в течение 90 сек (фаза "теплового шока") и быстро охлаждали в ледяной бане в течение 10 мин. Затем к суспензии клеток добавляли 400 мкл среды SOC и инкубировали при 37оС в течение одного часа для развития устойчивости к селективному антибиотику. Затем клетки высаживали на чашки Петри с 3.5% триптоз-агаром ("Ferak", Германия), содержащим антибиотик ампицилин в концентрации 75 мкг/мл, IPTG (0.8 мг на поверхность 60 мм чашки) и X-gal (0.8 мг на поверхность 60 мм чашки). После этого клетки инкубировали в течение ночи при 37оС. Бактериальные клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, отбирали методом бело-голубой селекции. Отобранные клоны высевали в 4 мл среды LB, содержащей ампицилин в концентрации 50 мкг/мл, инкубировали при 37оС в течение ночи и выделяли из бактериальных клеток рекомбинантные плазмиды.

Выделение плазмидной ДНК.

Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

Первый способ представляет собой метод щелочного лизиса ночной культуры бактерий (Маниатис с соавт., 1988). После осаждения бактерий из 4 мл среды LB центрифугированием в течение 1 мин осадок ресуспендировали встряхиванием в 300 мкл охлажденного во льду раствора 1 для выделения плазмид и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 600 мкл свежеприготовленного раствора 2 (лизирующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее добавляли 450 мкл охлажденного во льду раствора 3 (нейтрализующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Инкубировали в ледяной бане в течение 5 мин. После этого центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 5 мин при 4оС. Переносили надосадочную жидкость и добавляли к ней равный объем смеси фенол-хлороформ. Перемешивали в течение 2 мин интенсивным встряхиванием и центрифугировали в течение 2 мин. Затем к супернатанту добавляли равный объем хлороформа и повторяли процедуру. Далее осаждали ДНК двумя объемами этанола, выдержав в течение 5 мин при комнатной температуре, и центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 10 мин при 4оС. Осадок промывали 75% этанолом на 1 STE, высушивали в вакуумном эксикаторе, растворяли в 50 мкл буфера ТЕ и обрабатывали РНКазой 20 мкг/мл.

Второй способ представляет собой использование системы для выделения плазмид Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System ("Promega", США). Выделение проводили по протоколу, предложенному фирмой.

Количественную оценку плазмидной ДНК осуществляли спектрофотометрически. Сиквенс клонированного продукта ПЦР в составе вектора проводился на автоматическом сиквенаторе в институте Молекулярной биологии им. Энгельгардта, Россия.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!