Обратная транскрипция

Для обратной транскрипции использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК. Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл в следующих условиях: 1 буфер для обратной транскрипции, 0.01 М дитиотрейтол, 0.5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 10 пмоль гексапраймера и 200 ед. акт. обратной транскриптазы Superscript II RnaseH- ("GibcoBRL", США). Первоначально смесь РНК и гексапраймера в соответствующем объеме прогревали при 70оС в течение 10 мин. Затем охлаждали в ледяной бане и добавляли оставшиеся компоненты. Реакционную смесь выдерживали при 25оС в течение 10 мин для удлинения праймера и проводили основную реакцию обратной транскрипции при 42оС в течение 1 ч. Реакционную смесь прогревали при 70оС в течение 15 мин для инактивации фермента и разводили бидистилированной водой до конечного объема 100 мкл. Полученную кДНК в количествах подобранных экспериментальным путем использовали в полуколичественной ПЦР со специфическими праймерами. Условия проведения ПЦР описаны в п. 5.3.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!