Определение протеина

Видео: UDK 159-VELP Scientifica-Определение белка/протеина по методу Къельдаля

Наличие протеина в том или ином исследуемом материале устанавливают на основе количественного определения общего азота. Содержание же последнего можно установить методом Къельдаля. Этот метод заключается в том, что органические вещества при нагревании с концентрированной серной (Н2SО4) кислотой разрушаются, а весь аммиак улавливается кислотой, образуя с ней сернокислый аммоний. Из полученной соли аммиак вытесняется крепкой щелочью и поступает под действием водяного пара в титрованный раствор серной кислоты, где он вновь образует сернокислый аммоний. Затем оставшуюся в этом растворе свободную серную кислоту нейтрализуют титрованным раствором NaOH или КаОН, что дает возможность узнать, сколько азота заключено в аммиаке, прореагировавшем с кислотой. Установив количество азота в навеске исследуемого материала, вычисляют количество протеина, принимая при этом среднее содержание в нем азота 16%.

Ход определения

1. Насыпать в пробирку около 200300 мг исследуемого материала, находящегося в воздушно-сухом состоянии, и взвесить ее на аналитических весах.

Если определение протеина проводится непосредственно в сырой пробе, то берут на анализ 11,5 г исследуемого материала.

2. Перенести содержимое пробирки на дно колбы Къельдаля, предназначенной для сжигания органических веществ.

3. Взвесить пустую пробирку, а затем по разности между массой пробирки с содержимым и массой опорожненной пробирки установить величину навески, помещенной в колбу.

4. Отмерить в цилиндре 510 см3 концентрированной серной кислоты и облить ею помещенную в колбу навеску.

5. На кончике шпателя добавить в колбу в качестве катализатора около 100 мг медного купороса, а затем прикрыть ее стеклянной пробкой (втулкой).

6. Колбу вместе с содержимым поставить на нагревательный прибор (электроплитку или газовую горелку) в вытяжной шкаф и приступить к сжиганию органических веществ сначала на слабом огне, а затем, усилив огонь, довести содержимое колбы до полного осветления. Обычно сжигание продолжается несколько часов.

7. Выключить нагревательный прибор и дать колбе остыть.

8. Очень осторожно маленькими порциями прилить в колбу по ее стенкам небольшое количество дистиллированной воды и вновь перемешать.

9. Перелить содержимое колбы Къельдаля в мерную колбу емкостью 100250 мл.

10. Колбу Къельдаля несколько раз промыть дистиллированной водой, которую слить в ту же мерную колбу.

11. В мерную колбу долить до метки дистиллированной воды.

12. Закрыть мерную колбу пробкой и сделать несколько вертикальных перемешиваний ее содержимого.

13. Налить из микробюретки в сто- , двухсотмиллиметровую коническую узкогорлую приемную колбу 515 мл 0,01 – нормального раствора серной кислоты, добавить две капли двухцветного индикатора и поставить колбу под холодильник аппарата Къельдаля. Проследить за тем, чтобы конец трубки холодильника был погружен в отмеренное количество 0,01-нормального раствора серной кислоты.

14. Взять пипеткой из мерной колбы 1025 мл анализируемой жидкой пробы и перелить ее в отгонную колбу, вмонтированную в аппарат Къельдаля при помощи шлифа, соединяющего ее с насадкой.

15. Налить через воронку 6 (см. рис.1) в парообразователь аппарата Къельдаля дистиллированной воды не больше 2/3 объема колбы и включить нагревательный прибор.

16. После того как вода в парообразователе закипит, открыть кран воронки 15 и влить через нее в отгонную колбу 510 мл 33-процентного раствора едкого натра.

17. Не дожидаясь того момента, когда вся щелочь пройдет по трубке в отгонную колбу, промыть дистиллированной водой воронку и закрыть ее кран.

18. Отгонку аммиака продолжать 1020 мин. За это время аммиак, как правило, переходит из отгонной колбы в приемную. Для того, чтобы убедиться, что весь аммиак перешел в приемную колбу, обычно пользуются лакмусовой бумажкой, которая от капли отгона не должна менять свой цвет.

19. Промыть конец трубки холодильника дистиллированной водой, сливая воду в приемную колбу.

20. Отнять приемную колбу от холодильника, а затем включить нагревательный прибор.

21. Оттитровать содержимое приемной колбы 0,01- нормальным раствором едкого натра.

22. Из числа миллилитров 0,01-нормального раствора серной кислоты, первоначально взятого в приемную колбу, вычесть число миллилитров 0,01-нормального раствора едкого натра, пошедшего при титровании на нейтрализацию свободной кислоты, в результате чего будет получено число миллилитров 0,01-нормального раствора серной кислоты, пошедшее на связывание аммиака.

23. Умножить 0,14 на число миллилитров 0,01-нормального раствора серной кислоты, нейтрализованное аммиаком. Произведение покажет количество миллиграммов азота, которое содержалось в аммиаке, отогнанном из 1025 мл анализируемой жидкой пробы.

24. Установив массу азота в отогнанном аммиаке, определить путем арифметического пересчета общее количество азота во всем объеме исследуемой жидкой пробы, находящейся в мерной колбе. В результате будет получено количество азота, которое содержалось в сожженной навеске анализируемого материала.

25. Определить процент азота в воздушно-сухом веществе анализируемой пробы по формуле:



а х 100

Хо =---------- , где

Р2



Хо - процент азота в воздушно-сухом веществе-

а - масса азота во взятой на анализ навеске воздушно-сухого вещества-

Р2 - навеска воздушно-сухого вещества, взятая на анализ.

26. Сравнить полученную величину процента азота в воздушно-сухом веществе анализируемой пробы с величиной процента параллельного определения. Допустимое расхождение в данных величинах не должно превышать 0,15%.

27. Принять среднеарифметическую величину двух параллельных определений за процент азота в воздушно-сухом веществе анализируемой пробы.

28. Умножить процент азота, установленный для воздушно-сухого вещества анализируемой пробы, на коэффициент 6,25. В результате будет получен процент протеина в воздушно-сухом веществе данной пробы.

29. Установить при помощи пересчета процент протеина в абсолютно сухом веществе анализируемой пробы по формуле:



Хо х 100

Х =------------ , где

100 - В 1



Х – процент протеина в абсолютно сухом веществе-

Хо – процент протеина в воздушно-сухом веществе-

В1 – процент гигроскопической влаги в воздушно-сухом веществе.



30. Установить при помощи пересчета процент протеина в сыром материале анализируемой пробы по формуле:<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!