Биочип или микроматрица – устройство для ранней диагностики раковых клеток, слежения за лечением рака и контроля излечения

Биочип – это организованное размещение молекул ДНК или белка на специальном носителе – «платформе».

Платформа представляет из себя пластинку площадью всего 1 см2 или чуть больше. Она сделана из стекла или пластика, либо из кремния. На ней в строго определенном порядке может быть размещено множество молекул ДНК или белка. Отсюда и присутствие в термине слова – «микро».

На биочипе можно проводить анализ молекул различных веществ. Для этого на нем закрепляют «узнающие» молекулы. Каждую из таких молекул обозначают термином – «молекула-зонд», а каждую из исследуемых молекул –

«молекула-проба».

Молекула-зонд на биочипе определяется самим исследователем, т.е. он планирует, какую молекулу нужно искать среди молекул в исследуемом материале – в жидкости и т.д. Если на микрочипе исследуется ДНК – это ДНК-чип, если молекула белка – белковый чип.

Как фиксируются молекулы-зонды на биочипе?

Во многих странах молекулы-зонды прикрепляют прямо к стеклянной пластинке, т.е. к подложке при помощи лазеров. В нашей стране молекулы-зонды размещаются в ячейки из геля, диаметром менее 100 микрон каждая, ячейки фиксированы к пластинке в процессе изготовления микрочипа. Количество ячеек на чипе достигает уже несколько тысяч.

В ячейках молекулы-зонды химически привязаны и находятся в функционально активном состоянии.

Так как ячейки заполнены гелем трехмерной структуры, то они удерживают большее количество молекул-зондов, нежели чипы, в которых молекулы- зонды просто прикреплены к пластинке. Важно и то, что химическая реакция между молекулой-зондом и вносимой в ячейку из геля молекулы-пробы, протекает как и в жидкостях, а значит, как и в живом организме.

Изучение генома и протеома каждого типа клетки в норме и при любой болезни позволит выяснить – какой ген или гены вызывают ту или иную болезнь.

На ДНК-чипе выясняется причина возникновения болезни: дефекты в структуре гена или генов, или изменения активности гена при нормальной его структуре.

На белковом чипе определяются последствия «поломок» в гене по изменениям его продукта – белков в клетке. Изменения в гене клетки или белке – это их метка или маркер (от англ. mark – знак, метка).

Отсюда: ген с меткой – это ген-маркер, а белок с меткой – это белок- маркер. Эти маркеры позволяют обнаруживать у пациента дефектную или больную клетку, характерную для конкретной болезни, в том числе и раковую стволовую клетку. При диагностике болезни ген-маркер и белок-маркер для контроля сравнивают с нормальным геном клетки и его продуктом – белками.

Ясно, что на ДНК-чипе молекулой-зондом является ген-маркер, а для контроля в отдельной ячейке – нормальный ген, в белковом микрочипе в качестве молекулы-зонда может быть или антитело, или антиген.

Способы изготовления биочипов

1. Молекулы ДНК или белка предварительно синтезируют, а затем размещают на матрице. Недостаток этого метода: невысокая плотность молекулы- зонда на матрице – до 1000 молекул и трудоемкий процесс их синтеза.

Копии гена-маркера можно получить ПЦР-ММК методом, такого метода для копий белка-маркера нет. Его копии можно создавать встраиванием иРНК гена белка-маркера в бактерию: E. coli или в клетки дрожжей.

2. Для ДНК-чипов синтез олигонуклеотидов производят непосредственно на матрице. Такие чипы обладают гораздо большей плотностью молекул-зондов.

3. Нанесение олигонуклеотидов в строго определенное место матрицы струйным принтером.

В нашей стране биочипы – ДНК-чип и белковый чип готовят по первому способу.

Биочип – новейшее устройство для медицины XXI века. По молекулам-маркерам он позволяет:

1) диагностировать любую болезнь: до ее начала или в самом ее начале-

2) находить в организме тот или иной вирус, бактерии и раковые клетки-

3) белковым чипом можно находить лекарства среди низкомолекулярных соединений в целом ряде анализируемых материалов-

4) решение этих задач на биочипах можно сделать за считанные часы, а не дни и т.д.

Принцип действия биочипов и этапы анализа

1. ДНК-чип.

Мы знаем, что молекула ДНК состоит из двух комплементарных цепей. Основа каждой цепи – это последовательность из четырех азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Г) и цитозин (Ц).

При этом последовательность оснований одной цепи определяет последовательность оснований в другой: А-Т и Г-Ц. Когда между этими комплементарными основаниями спонтанно образуются водородные связи, две цепи соединяются, т.е. гибридизуются в двойную спираль и удерживают цепи вместе. Именно на способности комплементарных оснований связываться друг с другом: А с Т, а Г с Ц основан принцип действия ДНК-чипа.

Этапы анализа с помощью ДНК-чипа

1. В ячейках чипа фиксированы копии известного гена-маркера в виде одной цепи этого гена, т.е. его «половинки» – кДНК.

2. Из плазмы крови от пациента выделяется копия гена-маркера, т.е. иРНК.

3. На молекуле иРНК с помощью фермента обратной транскриптазы синтезируют другую цепь гена-маркера, т.е. вторую его «половинку» – кДНК. ПЦР-ММК размножают эту кДНК – это молекулы-пробы, и их метят флуоресцентным красителем.

4. Роботом помещают молекулы-пробы в определенные ячейки на чипе с копией генов-маркеров раковой стволовой клетки.

Если кДНК генов из образца плазмы комплементарна с кДНК в соответствующих ячейках, то между ними произойдет гибридизация, и такие ячейки начнут светиться. Чип сканируют лазером, следя за интенсивностью сигнала флуоресценции в каждой ячейке. То есть гены-маркеры в плазме есть, а значит, в организме пациента есть раковые стволовые клетки.

Если нет гибридизации между этими молекулами, значит, нет гена-маркера раковой стволовой клетки в этом образце плазмы.

Когда имеется ген с мутацией, тогда будет гибридизация его кДНК на чипе с кДНК молекулы-зонда, имеющей эту мутацию. Если это ген-супрессор wt53, то это также может указывать на наличие в организме пациента раковой стволовой клетки или клеток.

Раковая клетка возникает из стволовой клетки ткани из-за включения в ней генов фетальных белков. Поэтому в молекулах-пробах плазмы пациента будут кДНК этих генов и отсутствие их в контроле.

Чем меньше в образце плазмы от пациента титр эпимутантных и мутантных генов-маркеров, тем меньше раковых клеток в его организме.

Выявление раковых клеток в образце плазмы крови или других биологических жидкостей от пациента – моча, слюна, слезная жидкость и др. по генам- маркерам, дает возможность поставить диагноз рака, а по генам-маркерам свойства инвазии раковой клетки – микрометастазы рака. И это задолго до обнаружения их стандартными методами – УЗИ, рентгенография, компьютерная томография и др.

Биочипом по генам-маркерам можно выявлять угрозу болезни. Так, если обнаружены гены-маркеры, но еще нет их продуктов – белков в клетке, то это выявление предболезни. По отношению к раку – это предраковые клетки. Так как в этом случае биочип позволяет выявить только вероятность болезни, то такой чип пока не подвергается сертификации.

Плазма крови пациента – это главный резервуар, куда проникают гены- маркеры из погибающих дефектных или больных клеток при конкретной болезни из различных органов, в том числе из раковых клеток. Такие клетки в организме могут погибать за счет некроза и апоптоза, а их гены через межклеточную жидкость затем проникают в кровь.

Низкий титр генов-маркеров в плазме крови пациента по анализу на ДНК- чипе и отсутствии их продукта – белков, может означать предболезнь, а при наличии их – болезнь. В таком же смысле это касается и рака. Это могло бы означать раннюю диагностику рака – II ее уровень.

2. Белковый чип.

Строение чипа для анализа белков то же, что и у ДНК-чипов. Лишь те чипы, на которых проходит ферментативная реакция, имеют более редкое расположение ячеек, а те, на которых идет ДНК-реакция, – более частое.

Белки-маркеры – это продукт «поломок» гена или генов, они превращают нормальную клетку в дефектную или больную клетку при конкретной болезни. Эти белки появляются на поверхности клеток и являются белками-антигенами и для каждой болезни они свои.

На раковой стволовой клетке появляются фетальные белки и белки- рецепторы, которых нет на нормальной стволовой клетке. Являются ли они белками-антигенами – вопрос не решен.

В белковом чипе в качестве молекулы-зонда, т.е. белка-маркера дефектной или больной клетки может быть белок-антиген, тогда в сыворотке от пациента определяют антитела к нему. Если молекулой-зондом берется антитело, то в сыворотке крови от пациента ищут белок-антиген.

В связи с расшифровкой генома человека требуется анализ функций огромного количества белков в клетках разного типа, в том числе ранее неизвестных. Тысячи белков могут быть фиксированы в разных ячейках микрочипа и одновременно анализированы на способность: связывать известный лиганд, катализировать ту или иную ферментативную реакцию, взаимодействовать с антителами, низкомолекулярными соединениями и др.

В раковой клетке важно изучать кроме белков-маркеров, белков- рецепторов и антител к ним, белки свойства инвазии, фактор роста эндотелия сосудов-1 и белок-рецептор к нему на поверхности гемопоэтической клетки и др.

Принцип действия белкового чипа

Он также основан на комплементарности участвующих молекул, но белковых.

1. Антиген со своим антителом. Антиген – это любое вещество, в состав которого обычно входит какой-то белок, способный вызывать иммунную реакцию.

Антитело – это молекула белка, секретируемая одной из клеток иммунной системы. Форма этой молекулы и распределение электрического заряда по ее поверхности делают ее способной связывать антиген, комплементарный ей по форме и распределению заряда.

Впервые еще в 1942 г. нобелевский лауреат Л. Полинг и его коллеги выдвинули верный постулат, что трехмерная структура антигена и его антитела

комплементарны и, таким образом, «несут ответственность» за образование комплекса – антиген–антитело.

2. Субстрат со своим ферментом. На основе гипотезы топохимического соответствия специфичность действия фермента связана с узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают точечные контакты и водородные связи.

3. Белок с низкомолекулярным соединением. Для ингибирования белка необходима связь между ними – комплементарной поверхности соединения с активными участками молекулы белка,

4. Фермент с низкомолекулярным соединением. Ферменты и другие белки создают все свойства раковой клетки, поэтому они являются основными мишенями для лекарств. Для блокады фермента низкомолекулярным соединением также необходима между ними комплементарность: поверхность молекулы соединения при этом должна быть копией поверхности участка субстрата, которая не изменяется при катализе.

Этапы анализа с помощью белкового чипа

1. В ячейках чипа фиксирован известный белок-антитело к белку, который создает дефектную или больную клетку конкретной болезни. Искомый белок – это белок-маркер.

2. Из сыворотки крови от пациента берется образец сыворотки для анализа. В образец добавляют флуоресцентный краситель – каждая молекула белка- маркера получает это вещество.

3. С помощью робота капли сыворотки из образца помещают в определенные ячейки чипа. Молекулы-зонды ищут комплементарные им молекулы среди молекул-проб. Если есть такая молекула, то она связывается с молекулой-зондом в ячейке чипа- между ними происходит химическая реакция, и она начинает светиться.

4. Ячейки, в которых появилось яркое свечение, укажут на присутствие искомого белка белка-маркера. Так как этот белок-маркер из дефектной или больной клетки при конкретной болезни, это укажет на начало у пациента этой болезни. Точно также выявляют присутствие в организме пациента раковой клетки(-ок) по их белкам-маркерам.

Если в ячейках чипа фиксирован белок-антиген, тогда в сыворотке крови пациента ищут антитела к белку-маркеру. Если в сыворотке окажутся антитела к белку-маркеру, это будет указывать на наличие в организме пациента раковых клеток, т.е. пациент болен. А по белкам-маркерам свойства инвазии раковой клетки, например, по наличию белка Mts1 и других, можно регистрировать гдето в организме у пациента микрометастазы раковых клеток.

Мы уже знаем, что белки, которые образуются в раковых клетках, но отсутствуют в нормальных, это белки-маркеры или антигены. Наличие таких белков – признак того, что ген, вызывающий перерождение нормальной клетки в раковую, начал свою разрушительную работу. Выявление раковой клетки(-ок) по белкам-маркерам позволяет поставить диагноз рака или его микрометастазов задолго до выявления его симптомов у пациента. Титр белка-маркера в сыворотке крови пациента определяет количество раковых клеток в его организме. Низкий титр белков-маркеров из раковых клеток в сыворотке крови, а также в других жидкостях пациента – признак малого количества раковых клеток в организме пациента. Это могло бы стать ранней диагностикой рака – II ее уровень.

Итак, в XXI веке по мере выявления генов-маркеров и белков-маркеров, вызывающих конкретную болезнь, диагностика ее, в том числе и рака, станет ранней, т.е. на двух уровнях: 1) «до начала» – по генам-маркерам и 2) «в самом начале» – по белкам-маркерам.

Гены-маркеры и белки-маркеры в дефектной или больной клетке – это цели или мишени для новых лекарств. На их основе будут создаваться лекарства и другие средства, в том числе – вакцины. За счет комплементарности к молекулам-мишеням, лекарства будут действовать избирательно, не повреждая нормальные клетки.

Врач, действуя на гены-маркеры болезни, сможет ее предотвратить, а воздействиями на белки-маркеры клеток ее можно будет излечить в самом «зародыше».

Этими двумя путями врач получит, так сказать, полную власть над любой болезнью на клеточном уровне.

Поиск генов-маркеров и белков-маркеров в различных средах организма пациента быстро и точно можно выполнять на биочипах, а гены-маркеры, кроме этого, можно выявлять с помощью точнейших методов: ПЦР-ММК и МС- ПЦР. Это будет означать революцию в медицине.

Ученые выявят гены-маркеры и белки-маркеры, вызывающие конкретную болезнь, в том числе и возникновение раковой клетки. Тогда станет возможным разработать для ранней диагностики любой болезни минимум наборов: генов-маркеров и белков-маркеров. Они будут дополняться и уточняться по мере получения новых знаний. Это будет генный и белковый «профили» болезни, и которые будут перенесены на биочипы.

Тестирование человека на маркеры определенной болезни с помощью ДНК-чипа и белкового чипа имеет несколько преимуществ.

Отрицательный результат – принесет человеку радость и может избавить его от обследования стандартными методами: ультразвуковое исследование, рентгенография и др.

Положительный результат – даст человеку возможность, а также время на то, чтобы принять меры для снижения риска возникновения болезни, или при ее начале – начать соответствующее лечение.

Особое значение имеет ранняя диагностика рака. Это связано с тем, что, во-первых, причина рака – раковая клетка, а она из клетки своего организма- хозяина и, во-вторых, вплоть до недавнего времени не было известно абсолютных отличий раковой клетки от нормальной клетки.

До сих пор считается, что для каждого типа раковой клетки характерны «свои» гены и белки. Но геном в клетке каждого типа – один и тот же. Если принять, что из каждого типа клетки раковая клетка – «своя», тогда почему свойства раковой клетки любого типа – одинаковые?

Тип клетки создается репрессией одних генов – из-за метилирования и экспрессией других генов – за счет деметилирования их промотора.

Теперь также доказано, что клетка любого типа становится раковой за счет дерепрессии в ней генов фетальных белков. То есть формирование типа клетки и возникновение раковой клетки из нормальной клетки – это независимые друг от друга процессы. Из этих двух фактов можно допустить, что общие гены-маркеры и их продукт – белки для любого типа раковой стволовой клетки должны быть.

Общими генами и их продуктами – белками могут стать: ген и его фермент – теломераза, ген и белок под кодовым обозначением «5Т4», ген oct-4 и белок Oct-4, ген Nanog и белок, ген mts 1 и белок Mts 1, ген остеопонтин и белок и др.

Если это подтвердится, то это станет настоящим прорывом в решении многих, если не всех, проблем рака:

- ранняя и точная диагностика раковой стволовой клетки любого типа на основе общего гена-маркера и его продукта – белка-маркера-

- универсальные лекарства и средства, в том числе вакцина, против рако-стволовой клетки и ее метастазов.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!