Методы диагностики in vitro
Видео: Молекулярные методы QF-PCR для рутинной пренатальной диагностики in vitro.
Диагностика аллергии по анализам крови — современное направление в аллергологии. В отличие от кожных проб и провокационных тестов анализы крови не приводят к развитию аллергических реакций у пациента, практически не имеют противопоказаний и рекомендуются при любой форме аллергии. Основными показаниями являются:– ранний детский возраст-
– высокая степень сенсибилизации пациентов-
– непрерывно рецидивирующее течение заболевания без периодов ремиссии-
– невозможность отмены антигистаминных и других препаратов-
– поливалентная сенсибилизация, когда отсутствует возможность проведения тестирования in vivo сразу со всеми предполагаемыми аллергенами в ограниченные сроки обследования-
– резко измененная реактивность кожи-
– ложноположительный или ложноотрицательный результат при кожном тестировании-
– уртикарный дермографизм.
Основными преимуществами методов специфической диагностикиin vitro являются:
– безопасность для больного-
– высокая стандартность и воспроизводимость-
– возможность количественного (цифрового) учета-
– возможность автоматизации-
– возможность проведения исследования в случае, когда пациент находится от аллерголога на большом расстоянии и доставлена лишьсыворотка больного-
– малое количество крови для исследования.
Современные методы, применяемые для in vitro-диагностики аллергических заболеваний, представлены в табл. 1.
Таблица 1
Современные методы, применяемые для in vitro-диагностикиаллергических заболеваний
Видео: Метод пренательной диагностики Prenatest
width="482" alt="Принцип постановки ИФА для определения IgE" />
Рис. 6.
Принцип постановки ИФА для определения IgE
После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат рас-щепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции- интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и меченых антител. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем промывания. Учет интенсивности реакций опытных и кон-трольных проб проводят на планшетном спектрофотометре (ИФА-ридере) по величине поглощения света с определенной длиной волны (для хромогена ТМБ (тетраметилбензидин) она составляет 450 нм).
2. Хемилюминесцентный («сэндвич») анализ с применениемпарамагнитной метки.
К сыворотке крови пациента добавляют анти-IgE-АТ, меченные люминесцентной меткой (эфиром акридина). После отмывки не-связавшихся антител добавляют анти-IgE-антитела, ковалентно связанные с парамагнитными частицами. Для учета необходимо специ-альное измерительное устройство, которое включает фотометр и электрод с магнитом. Магнит захватывает парамагнитные частицы, связанные с IgE-конъюгатами,в результате электрохимической реакции происходит люминесценция метки, которая измеряется фотометрически. Примерами таких устройств являются системы ACS:180 (Ciba Corning Diagnostics Corp.), NPD (Calgon Vestal Laboratories), Clorox (Clorox Company). Метод является высокочувствительным и позволяет определять концентрацию общего уровня IgEв диапазоне 1,5–3000 кЕ/л.
3. Радиоиммунный анализ (РИА) — метод, основанный на мечении одного из компонентов иммунологической реакции (антигена илиантитела) радиоактивным изотопом I125. Для количественного определе-ния уровня общего IgE применяют непрямой или конкурентный твердофазный РИА (на твердой фазе иммобилизированы захватывающие антитела против IgE человека). В последнем случае в систему одновременно вносят сыворотку пациента и определенное количество IgE, меченного I125. В результате реакции происходит связывание данного компонента, обратно пропорциональное содержанию IgE в сыворотке пациента.Результаты оценивают с помощью гамма-счетчика по радиоактивности образующихся иммунных комплексов.
Поскольку РИА требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами, он малоиспользуется в настоящее время.
Методы, используемые в современной практике для определе-ния аллергенспецифических IgE в сыворотке крови
Высокочувствительными и специфичными методами определения аллергенспецифических IgE-антител являются РАСТ, МАСТ, иммуноблотинг, твердофазный ИФА, микроэррей.
РАСТ (радиоаллергосорбентный тест) — метод определенияспецифических IgE-антител в сыворотке крови пациента к аллергену, предварительно сорбированному на пористом носителе (рис. 7).
В сыворотку больного вносится нерастворимый полимер — аллер-генный конъюгат, который сорбирует на себе специфические по отношению к используемому аллергену антитела. Далее добавляют антиглобулиновую сыворотку (против IgE), меченную радиоактивным изотопом.После отмывки несвязавшихся реагентов, результаты оценивают с помощью гамма-счетчиков по уровню радиоактивности образующихся иммунных комплексов в сопоставлении с контролем и стандартной кри-вой.
Определение специфических IgE с помощью РАСТ показано при высоком риске анафилактических реакций, поражении кожи и проведении лечения, влияющего на результаты кожных проб.
В настоящее время широкое распространение получили РАСТ третьего поколения, которые характеризуются большой чувстви-тельностью и специфичностью, автоматизацией, использованием флюорохромных, ферментных меток или хемилюминесцен-ции.
width="516" alt="Принцип постановки РАСТ (по L. Wide)" />
Рис. 7.
Принцип постановки РАСТ (по L. Wide)
Определение аллергенспецифических IgE в РАСТ с применени-ем флюоресцентной метки
К аллергену, сорбированному на целлюлозном носителе, добавляют сыворотку крови пациента. Затем добавляются меченные ферментом(?-галактозидазой) анти-IgE-АТ, которые связываются с образовавшимся конъюгатом. После отмывания несвязавшихся антител добавляютсубстрат (4-метилимбеллиферил-?-D-галактозид), в случае ферментации которого образуются флуоресцентные вещества, концентрация которых выявляется при помощи ридера (FluoroCount).
В качестве примера метода, основанного на эффекте хемилюминес-ценции, можно привести МАСТ.
MACT (множественный аллергосорбентный тест) — метод определения аллергенспецифических IgE, аналогичный по принципу постановки РАСТ, где аллерген сорбирован на целлюлозных нитях, а в качестве индикатора реакции используются фотореагенты, свечение которых регистрируется на пленке Polaroid, на люминометре, на фотометре(рис. 8). Метод позволяет быстрее получить результаты исследования,дает возможность определять необходимые параметры даже у одного больного, не ожидая накопления проб для использования целого набора.
width="583" alt="Устройство для постановки МАСТ" />
Рис. 8.
Устройство для постановки МАСТ
:1 — MAST-панель в сборе- 2 — крышка- 3 — целлюлозные нити с адсорбированным аллергеном- 4 — корпус
Псевдоиммуноблот — метод, позволяющий одновременно выявлять специфические IgE-антитела к спектру аллергенов (к каждому из них)в сыворотке или другом материале. Псевдоиммуноблот основан на твердофазном ИФА, но в отличие от последнего обладает большей специфичностью (но меньшей чувствительностью), быстротой выполнения, минимальным объемом крови (менее 0,5 мл), возможно-стью одновременного тестирования с большим числом аллергенов (около 20 в каждой панели). Кроме того, сейчас применяется про-граммная высокоточная обработка результатов.
Современные тест-системы построены по принципу двухуровневого определения аллергостатуса: на первом уровне производится стандартное аллергообследование, позволяющее определить группу аллергенов,к которой имеется чувствительность. После этого возможно проведение расширенного (более точного и сложного) определения чувствитель-ности к конкретному аллергену.
Классический иммуноблот применяют в случае наличия четких указаний на причинный аллерген (данные анамнеза, элиминационного теста и др.) и отрицательных результатов тестирования на специфический IgE с охарактеризованными компонентами этого ал-лергена. В таких случаях из грубого экстракта аллергена получают блоты и проводят анализ сыворотки больного на наличие IgE, специфичных к минорным (не охарактеризованным) компонентам аллергена.
Микроэррей (microarrey) является сравнительно новым (разрабо-танв 1990-х гг.) и весьма перспективным направлением в прикладной молекулярной биологии. В настоящее время наибольшее распро-странениеполучила технология микроэррея, основанная на ДНК-олигонуклеотидах, однако развивается и микроэррей с применением моноклональных антител и рекомбинантных антигенов. В частности, подобная технологияприменяется для диагностики и оптимизации лечения аллергий (рис. 9).
width="544" alt="Схема проведения микроэррея для диагностики аллергии" />
Рис. 9.
Схема проведения микроэррея для диагностики аллергии
Исследование проводится в несколько этапов:
1. Приготовление микрочипа: рекомбинантные аллергены раскапываются на поверхность активированного предметного стекла (объемкапли — нанолитры, количество антигена — десятки пикограмм). Одно стекло содержит 12 ячеек. Каждая ячейка содержит десятки (сотни) различных аллергенов и калибровочную кривую (возрастающие количества IgE) в триплетах. Таким образом, одновременно можно обследовать до12 пациентов.
2–3. Ход теста:
а) раскапывание сывороток пациентов (15 мкл)-
б) инкубация (IgE пациента соединяются с аллергенами)-
в) добавление моноклональных антител против IgE, меченных флуорохромом-
г) сканирование микрочипа-
д) типичная сканограмма микрочипа:
– первые три ряда = калибровочная кривая (интенсивность свечения пропорциональна количеству фиксированных IgE)-
– далее — профиль сенсибилизации пациента (специфичность и количество IgE в сыворотке пациента).
Тесты активации клеток аллергенами (CAST) являются современными методами диагностики ГНТ медиаторного типа, не обу-словленной IgE (рис. 10).
width="484" alt="Принцип постановки CAST/FAST" />
Видео: ЭКО. ИКСИ. Зачатие in vitro
Рис. 10.
Принцип постановки CAST/FAST
:1 — стимуляция базофилов (IgE-зависимая, с помощью аллергена- с помощью анти-FceRI-антител- IgE-независимая, с помощью пищевых добавок, нестероидных противовоспалительных средств (аспирин), лекарственных препаратов)- 2 — идентификация базофилов. Проводится только для FAST, обычно с помощью мече-ных антител против IgE или рецепторов к хемокинам CCR3- 3 — учет реакции. CAST учитываютс помощью количественного определения лейкотриенов (тИФА). FAST — путем определения процента активированных базофилов (экспрессирующих CD63) с помощью цитофлуориметрии
Ранее подобную реактивность выявляли в тестах повреждения лейкоцитов и стимуляции выделения гистамина базофилами, однако они слишком трудоемки, плохо воспроизводятся и не поддаются стандартизации. СAST/FAST ставится в несколько стадий:
1. Выделение лейкоцитов крови:
а) к стабилизированной крови добавляют декстран для осаждения эритроцитов-
б) надосадок центрифугируют для осаждения лейкоцитов (удаление декстрана и тромбоцитов)-
в) осадок лейкоцитов ресуспендируют в буферном растворе, содержащем ИЛ3.
2. Стимуляция лейкоцитов:
а) с анти-FceRI-антителами (положительный контроль)-
б) физиологическим раствором (отрицательный контроль)-
в) аллергеном(ами) в различных концентрациях.
3. Супернатанты отбирают и немедленно определяют содержание лейкотриенов с помощью твердофазного ИФА. Для количественногоопределения необходимо использовать несколько разведений стандартов для построения калибровочной кривой.
4. Интерпретация теста. Для пищевых аллергенов нижний (пороговый) уровень (cut off) обычно равен 400 пг/мл- для пищевых добавок,лекарственных аллергенов, аэроаллергенов — около 40 пг/мл.
FAST отличается от CAST способом учета активированных базофилов: обнаружение и подсчет процента клеток, экспрессирующих CD63и связанные IgE (рис. 11). Интересующие нас клетки должны иметь свя-занные на поверхности IgE, т. е. связывать анти-IgE-антитела, меченные FITC, и сильно светиться зеленым. Активированные тучные клетки,помимо этого, экспрессируют CD63, связывают анти-CD63-антитела,меченные РЕ, и светятся красным. Таким образом, тест положительный, если значительный (>5–15 %) процент клеток (точки на графике) обнаруживается во втором квадранте. В настоящее время существуют коммерческие наборы для постановки комбинированных тестов (CAST и FASTв одной пробирке).
Следует отметить, что CAST/FAST выявляет выделение лейкотрие-нов лейкоцитами как в связи, так и без наличия аллерген-специфических IgE. Основные показания для применения CAST/FAST: подозрение на ГНТ по медиаторному типу и отсутствие специфических IgE- наличие гиперчувствительности к пищевым добавкам и лекарственным аллергенам- диагностика аспириновой астмы и подобных состояний. CAST/FAST не рекомендуются как тесты для первичного аллергологического обследования (они сложнее, дороже и уступают стандартным тестам обнаружения специфических IgE (UniCAP и т. д.)).
width="600" alt="Учет FAST" />
а бРис. 11.
Учет FAST
:а — отрицательный контроль- б — положительный контроль. Обозначения: PE —фикоэритрин (красное свечение)- FITC — флуоресцеин (зеленое свечение)- Q1-4 — квадранты на графике распределения клеток (Q1 — сильное красное свечение, слабое зеленое- Q2 — сильное красное и сильное зеленое- Q3 — слабое красное и слабоезеленое- Q4 — слабое красное и сильное зеленое свечение)
Методы, направленные на исследование проаллергическихцитокинов и медиаторов иммунного воспаления.
Определение медиаторов и цитокинов в системном кровотоке (обычно методом твердофазного ИФА):
1. Выявление гистамина затруднено крайне высокой скоростью его инактивации (минуты), поэтому для обнаружения его наличия в системной циркуляции (анафилактический шок) чаще применяют опре-деление метил-гистамина в моче (высокий уровень сохраняется несколько часов после исчезновения проявлений системной анафилаксии).
2. Определение триптазы в сыворотке крови. Триптаза содержитсяв гранулах тучных клеток и длительно (несколько часов) сохраняетсяв циркуляции.
3. Определение цитокинового статуса периферической крови (ИЛ4, ИФН?, ИФН?/ИЛ4) дает крайне общее представление о харак-тере типа реагирования иммунной системы в момент проведения теста. Было популярно в 80-е гг. прошлого века. Позже — в 90-е гг. модель Th1/Th2 уступила место исследованию роли Т-регуляторов при аллергии.
4. Определение содержания клеток, секретирующих те или иные цитокины. В настоящее время имеется возможность определения этих параметров для аллергенспецифических клеток (технология тетрамеров). Чаще для указанных целей применяют проточную ци-тофлуориметрию и элиспот.
Определение цитокинов и медиаторов в тканях (позволяет выяснить природу воспаления, его интенсивность, преобладающие звенья патогенеза):
1. Определение NO в выдыхаемом воздухе: простой неинвазивный тест, позволяющий отслеживать интенсивность воспалительного процесса в дыхательных путях (контроль лечения бронхиальной астмы).
2. Определение медиаторов и цитокинов в смывах, экссудатах и другом отделяемом поврежденных тканей.
3. Определение клеток, синтезирующих цитокины и медиаторы на срезах из биопсий поврежденных тканей.
4. Количественное определение мРНК цитокинов и медиаторовв смывах, соскобах и биопсийном материале.
Необходимо отметить, что методы определения цитокинов приаллергических процессах используются, в основном, для научных целей.
Тесты, имеющие историческое значение
Тест Шелли/Шварца — дегрануляция базофилов/тучных клетокв присутствии специфического аллергена. Тест широко использовался при лабораторной диагностике аллергических заболеваний ГНТ I типа.
Непрямой базофильный тест (тест Шелли). Этот тест основанна изучении морфологических изменений базофилов в результате взаимодействия сыворотки больного и специфического аллергена. Краситель нейтральный красный избирательно окрашивает гранулы базофиловв кирпично-красный цвет, что позволяет отличать их от других клеток. Реакцию наблюдают под микроскопом с иммерсионной системой. Неизмененные базофилы имеют округлую форму- гранулы, окрашенные краской, располагаются внутри клетки. Положительная реакция проявляетсяв деформации клеток, образовании псевдоподий, усиленном движении гранул и в редких случаях – выходом гранул из клетки с разрывом ее.В каждом препарате насчитывают 40 базофилов, вычисляют процентморфологически измененных клеток и в опыте, и в контроле.
Условно выделяют 3 степени реакции: слабую (процент измененных базофилов в опыте превышает таковой в контроле на 10 %), умеренную (на 15 %), резко положительную (на 20 % и более). Во всех случаях имеются в виду результаты контроля с наивысшей не-специфической реакцией базофилов.
Прямой базофильный тест (тест Шелли). Данный тест основан на изучении морфологических изменений базофилов периферической крови пациента с аллергическим заболеванием при взаимодействии со специфическим аллергеном. Оценка реакции проводится аналогично оценке при непрямом базофильном тесте.
Реакция повреждения гранулоцитов (РПГ), показатель повреждения нейтрофилов (ППН), реакция выброса из лейкоцитов калия, ферментов и т. д. Существует большое количество методик в рамках указанного подхода. Например, выделенные лейкоциты инкубируютсяс раствором аллергена в течение определенного времени, после чегоповреждение нейтрофилов регистрируется:
– морфологически: по изменению морфологии, путем окрашивания трипановым синим, бромистым этидием и т. д. (окрашиваются поврежденные/мертвые клетки)-
– фотометрически: прирост концентрации ионов калия определяют на пламенном фотометре, выброс миелопероксидазы — по ферментации субстрата-хромогена и изменению цвета раствора — на планшетномфотометре.
Реакция высвобождения гистамина из базофилов периферической крови человека основана на учете высвобождения гистамина после обработки базофильных клеток специфическими аллергенами. Стимуляторами высвобождения гистамина из клеток являются аллергены, анти-IgE, С5а. Ряд цитокинов — ИЛ-3, ИЛ-5, КСФ-ГМ — усиливают высвобождение гистамина базофилами. Тест использовался с целью выявления степени сенсибилизации организма in vitro при крапивнице, атопическом дерматите и в экспериментальных исследованиях.
Тесты, не рекомендующиеся для применения и/или интерпре-тации:
1. Определение IgG, в т. ч. IgG4 (за исключением случаев, когда это имеет значение).
2. Кинезиология (метрия) — контакт (демонстрация) больного с аллергеном и одновременное измерение относительной мышечной силы.В случае обнаружения причинного аллергена сила уменьшается. Приобнаружении специфического антидота — восстанавливается.
3. VEGA (электродермометрия, тест Фолля) — измерение сопротивления кожи (тканей) между акупунктурными точками при од-новременном контакте (демонстрации) с аллергеном. Существуют коммерческие аппараты и тест- системы.
4. Аурикулокардиальный рефлекс — измерение параметров кровенаполнения/пульса и т. д. в момент контакта с аллерге-ном.
5. Тест провокации-нейтрализации: постановка кожных или других проб с постепенным увеличением концентрации аллергена до достижения выраженной реакции. Таким образом находят разрешающую концентрацию. Далее ставят пробы, постепенно уменьшая концентрацию аллергена, до исчезновения реакции. Эта концентрация может применяться дляспецифической десенсибилизации.
6. Анализ реакции крови: каплю крови смешивают с растворами аллергенов/пищевых продуктов и т. д. Через некоторое время микроскопически изучают изменения в опытной капле по сравнению с контрольной.
7. Иридодиагностика аллергии.
8. Диагностика аллергии по нарушению циркуляции различных мистических видов энергии человеческого тела или духа.
Поделиться в соцсетях:
Похожие
