Лабораторная диагностика сифилиса

Видео: Иммуноферментный анализ (ИФА-диагностика)

Обнаружение бледных трепонем в биологическом материале.

А) Темнопольная микроскопия.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонем.При первичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделения эрозивно-язвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врожденного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость.При микроскопическом исследовании бледные трепонемы имеют вид тонкой спирали с 8 -12 равномерными завитками. В тёмном поле зрения можно наблюдать поступательное вращение трепонемы вокруг оси, ротационное и сгибательное. Важным признаком является излом в средней части ("приглаженный утюгом"), что отличает возбудителя сифилиса от других трепонем.При отрицательных результатах микроскопическое исследование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического исследования.Обнаружение специфических микроорганизмов с характерной морфологией, подвижностью и антигенной специфичностью позволяет поставить диагноз сифилиса при первичном, вторичном, раннем врождённом, рецидивном сифилисе даже без учёта результатов серологических тестов. Следует учитывать, что отсутствие микроорганизмов ещё не исключает диагноз сифилиса. Отсутствие трепонем в типичных очагах поражения может быть обусловлена длительностью существования очага, предварительным лечением пациента или плохой техникой взятия образца или просмотра материала. При отсутствии возбудителей в очаге поражения следует исключить возможность других заболеваний (герпес, мягкий шанкр).

Б) Полимеразная цепная реакция.

Применяется для определения специфических последовательностей ДНК. Метод заключается в многократном увеличении (амплификации) количества ДНК диагностируемого микроорганизма. Разработка вариантов ПЦР для диагностики сифилиса обусловливается недостаточностью стандартных тестов при раннем серонегативном, врождённом сифилисе и нейросифилисе. Обнаружение T. pallidum с помощью ПЦР значительно облегчается выраженным генетическим консерватизмом и практическим отсутствием рекомбинаций даже между подвидами. Большим достоинством ПЦР является возможность автоматизации реакции путём заданного циклического температурного режима.Применение ПЦР может иметь большое значение при диагностике врождённого сифилиса (пассивный трансплацентарный перенос антител не влияет на результаты теста), нейросифилиса (чувствительность существующих тестов около 50%), первичного серонегативного (в настоящее время одним из критериев является прямое микроскопическое обнаружение трепонем), а также при диагностике сифилиса у ВИЧ-инфицированных.

2. Нертрепонемные тесты.

Нетрепонемные тесты определяют антитела класса IgG и IgM к липидам (фосфолипидам), липопротеидам, высвобождаемых из поврежденных клеток хозяина, вследствие сифилитической инфекции и липидам, входящим в состав мембраны бледной трепонемы. Антилипидные антитела могут появляться не только вследствие сифилиса или других трепанематозов, но и в ответ на некоторые острые и хронические заболевания, при которых наблюдается разрушение тканей. Антилипидные антитела (реагины) образуются через 7-14 дней после образования шанкра или через 4-5 недель после инфицирования. В основном нетрепонемные тесты применяются в двух случаях:

• Нетрепонемные тесты, в связи с дешевизной, доступностью простотой и быстрым сроком исполнения, применяются для скрининга сифилиса как отборочные реакции.

• По изменению количественных нетрепонемных тестов судят о степени эффективности лечения сифилиса и устанавливают его излеченность. Поэтому нетрепонемные тесты применяются в комбинации с трепонемными тестами для установки диагноза сифилиса и проводятся до начала лечения, в процессе лечения и после окончания лечения в определенные временные интервалы.

Недостатки нетрепонемных тестов:

1) Ложноотрицательные результаты - при исследовании неразведенных образцов сыворотки, содержащих большое количество антител, за счет так называемого феномена прозоны. Это явление может наблюдаться на ранних стадиях сифилиса и у пациентов с сопутствующей ВИЧ-инфекцией.

2) Недостаточная чувствительность для диагностики поздней стадии сифилиса

3) Ложноположительные результаты (биологические ложноположительные реакции) при наличии других острых или хронических заболеваний.

А) Тест быстрых плазменных реагинов (RPR).

RPR (Rapid Plasma Reagins) - тест быстрых плазменных реагинов и его автоматизированная модификация - автоматизированный реагиновый тест (ART, Automated Reagin Test). Эти тесты могут считываться визуально из-за наличия окрашенных веществ в приготовленном антигене. Тест RPR был разработан для полевых условий и сейчас это наиболее распространенный нетрепонемный тест. Он проводится на пластиковых планшетках с впечатанными кружочками. При постановке количественной или качественной модификаций реакции стандартные количества неразведенной сыворотки или ее серийных разведений смешиваются с антигеном, содержанием частицы угля. Планшету с антигеном и сывороткой вращают при 1000 об/мин в течение 8 мин. Антиген не прикрепляется к этим частицам, но при наличии в сыворотке антикардиолипиновых антител происходит флоккуляция комплексов антиген-антитело, частицы угля как бы попадают в ловушку в образовавшуюся сеть и коагулируют. Результаты теста читаются во влажном месте при ярком тесте немедленно после проведения реакции. В тесте используется непрогретая сыворотка.

Б) VDRL-тест.

VDRL (по названию лаборатории-разработчика — Venereal Disease Research Laboratory). В данном тесте свежеприготовленный антиген и инактивированная сыворотка смешиваются в стеклянной лунке механическим вращением. Если в сыворотке присутствуют антитела к кардиолипиновому антигену, образуются агрегаты в виде коротких стержневидных структур, выявляемые микроскопически. Используется количественная модификация VDRL до разведений сыворотки 1:64. VDRL является единственным тестом, рекомендуемым для исследования спинномозговой жидкости.

В) Реакция связывания комплемента (РСК, реакция Вассермана).

Реакция Вассермана основана на феномене связывания комплемента. В постановке реакции используют как специфические антигены из бледных трепонем, так и неспецифические антигены (кардиолипиновый - экстракт из мышцы бычьего сердца).Степень позитивности реакции Вассермана оценивают числом плюсов:++++ (резко положительная)+++ (положительная)++ (слабоположительная)+ (сомнительная)- (отрицательная)Реакция Вассермана обязательно применяется в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закс-Витебского). Иммунологическая сущность этих реакций не отличается от РВ, но для них готовят более концентрированные антигены, которые при взаимодействии с реагинами сыворотки дают видимый осадок, оцениваемый качественно (++++, +++, ++, +, -).Диагноз первичного серонегативного сифилиса ставят только при отрицательных стандартных серологических реакциях. Реакция Вассермана (РВ) становится положительной у 100% больных во вторичном серопозитивном периоде сифилиса. При третичном активном сифилисе – у 65-70% пациентов. При поздних формах сифилиса внутренних органов и нервной системы – у 50-80% больных. У больных ранним врождённым сифилисом серологические реакции положительны почти в 100% случаев. При позднем врождённом сифилисе – в 75-80% случаев.

3. Трепонемные тесты.

Как и при нетрепонемных тестах при проведении трепонемных тестов используется иммунологическая реакция антиген-антитела. Но в качестве антигенов применяются трепонемные антигены - либо интактные трепонемы, либо очищенные и ультраозвученные трепонемы, либо рекомбинантные антигены. Для проведения и обнаружения результатов реакции антиген-антитела используют более сложные и дорогие методы.

Трепонемные тесты являются подтверждающими сифилис тестами, однако в небольшом проценте при их проведении могут встречаться ложноположительные результаты.Трепонемные тесты применяются только для диагностики сифилиса и не используются для проведения контроля излеченности.

А) Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих антител, так как меченые флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах ртутно-кварцевой лампы.Отличительной чертой РИФ, по сравнению со стандартными серологическими реакциями, является более высокая чувствительность (РИФ бывает положительной уже в первичном серонегативном периоде сифилиса) при высокой специфичности. Отмечена ценность РИФ при выявлении больных со скрытыми и поздними формами сифилиса при отрицательных результатах РИБТ. Реакция ставится в нескольких модификациях и наиболее ценной является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифических результатов комплекса серологических реакций и серодиагностика скрытого сифилиса. Однако РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о наличии или отсутствии заболения должен решаться на совокупности клинических и других серологических данных.

РИФ при вторичном сифилисе положительна в 100% случаев. При третичном активном сифилисе РИФ положительна у 92-100% пациентов. При поздних формах сифилиса внутренних органов и нейросифилиса РИФ положительна у 94-100% больных. У больных ранним и поздним врождённым сифилисом РИФ положительна в 100% случаев.

РИФ очень медленно негативируется в процессе противосифилитической терапии. Вследствие этого она непригодна для контроля за ходом лечения.

Б) Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

Гемагглютинационный тест для определения специфических антител к Treponema pallidum. В РПГА используются антигены из трепонем, поэтому он наиболее специфичен. Чувствительность и специфичность эквивалентна РИФ-абс. РПГА позволяет определить наличие антител в образцах, не реагирующих в реагиновых тестах. Позитивный образец, выявленный при скрининге, можно количественно оценить при использовании реагентов TPHA-nosticon.

В) Иммуноферментный анализ (ИФА).

В основе метода ИФА лежит следующий принцип: на твердофазном носителе (в отечественных тест-системах и в большинстве тест-систем зарубежного производства в качестве носителя используется поверхность лунок полистиролового планшета) фиксируется антиген возбудителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твёрдого носителя, принято называть иммуносорбентом. Как правило, в состав набора тест-системы входит уже готовый иммуносорбент.

В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличии в ней антител к данному антигену происходит их связывание в комплекс “антиген–антитело”. После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с мечеными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгатом), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам “антиген–антитело” антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (в случае использования пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании с ортофенилендиамином (ОФД), 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК) или тетраметилбензидином (ТМБ)). Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки. Некоторые иммуноферментные тест-системы допускают визуальную оценку результатов, что может быть полезно при отсутствии соответствующего оборудования.

В настоящее время Министерством здравоохранения России рекомендованы к применению в медицинской практике 10 иммуноферментных тест-систем для диагностики сифилиса отечественного производства:

1. “РекомбиБест антипаллидум”, ЗАО “Вектор-Бест”, п. Кольцово, Новосибирская обл.-

2. “РекомбиБест антипаллидум — суммарные антитела”, ЗАО “Вектор-Бест”, п. Кольцово, Новосибирская обл.-

3. “ИФА–АНТИ–LUIS”, НПО “Диагностические системы”, г. Нижний Новгород-

4. Тест-система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum) на основе рекомбинантных белков, БТК “Биосервис”, г. Москва-

5. “ЛюисСкрин”, ЗАО “Ниармедик” и АЗОТ “Диаклон”, г. Москва-

6. “ЭКОлаб–антипаллидум–скрин”, ТОО “ЭКОлаб”, г Электрогорск, Московская обл.-

7. “ИФА–анти-трепонема”, ЗАО “Вектор-Майстар”, п. Кольцово, Новосибирская обл.-

8. “АТ–Треп.–ИФТС”, ГП “Аллерген”, г. Ставрополь-

9. “Сиф–Ат–№№1,2”, ТОО НИИ “Аквапаст”, г. Санкт-Петербург-

10. “ИФАанти-СИФ”, НПК “Препарат”, г. Нижний Новгород.

Г) Иммуноблотинг.

Одним из современных методов диагностики сифилиса является иммуноблотинг (Western blot) для определения IgG либо IgM. При проведении иммуноблотинга T. pallidum подвергаются электрофорезу в градиенте концентрации додецилсульфата натрия, в результате чего происходит разделение белковых иммунодетерминант на нитроцеллюлозе. Затем производится обработка разделенных "точек" (blots) исследуемой сывороткой и антителами к IgG либо IgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. IgG - иммуноблотинг по чувствительности и специфичности подобен РИФ с абсорбцией. Применение анти-IgM специфического конъюгата при проведении иммуноблотинга может служить диагностическим тестом для врожденного сифилиса, более чувствительным по сравнению с РИФ с абсорбцией.

Д) Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ).

РИБТ является диагностически ценной и признана самым специфичным тестом на сифилис. Однако её применение ограничивается из-за дороговизны исследований и сложности проведения реакции. Постановка РИТ имеет особое значение при диагностике скрытого сифилиса, распознавании поражений внутренних органов и нервной системы, при обследованиях беременных с подозрением на сифилис. Сущность реакции заключается в потере подвижности бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и РИБТ становится положительной позже стандартных серореакций и РИФ.Оценка результатов реакции проводится по проценту иммобилизации бледных трепонем:

? до 20% - отрицательная-

? 21 - 30% - сомнительная-

? 31 - 50% - слабоположительная-

? 51 -100% - положительная.

В первичном периоде сифилиса РИБТ у большинства больных отрицательная или слабоположительная. При вторичном свежем сифилисе РИТ даёт положительный результат более чем у половины больных, однако, процент иммобилизации трепонем невысокий (40-60%). Во вторичном рецидивном периоде сифилиса РИТ бывает положительной у 85-90% больных при выраженной степени иммобилизации (80-100%). При третичном сифилисе, при специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, когда РВ часто отрицательная, РИБТ даёт положительные результаты в 98—100% наблюдений (с высоким процентом иммобилизации). В связи с медленной негативацией в процессе противосифилитической терапии, РИБТ непригодна для контроля за ходом лечения.При раннем врождённом сифилисе РИБТ положительна у 90-98% детей, при позднем врождённом сифилисе - почти у 100% больных. Диагноз скрытого серо-позитивного сифилиса ставится только по положительным серореакциям крови с обязательным подтверждением их РИБТ.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!