Оценка функциональной активности лимфоцитов

Видео: Кудрявцев И. В. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

А. B-лимфоциты

1. Исследование функций B-лимфоцитов in vivo

а. Исследование функций B-лимфоцитов начинают с определения уровня иммуноглобулинов в сыворотке. Для этого чаще всего применяют нефелометрию и простую радиальную иммунодиффузию. Результаты исследования оценивают с учетом возраста (см. приложения IV и V). Пол и расовая принадлежность почти не влияют на уровень иммуноглобулинов в сыворотке.

б. Для углубленной оценки гуморального иммунитета определяют уровень подклассов IgG. Хотя в большинстве случаев изменение уровня подклассов IgG не сопровождается выраженными клиническими проявлениями, у больных с рецидивирующими инфекциями относительное содержание подклассов IgG значительно отличается от нормы. При этом общий уровень IgG и других иммуноглобулинов может быть нормальным. Поскольку определение подклассов IgG — дорогостоящий метод, он применяется в редких случаях. Наряду с определением подклассов IgG при диагностике иммунодефицитов оценивают также гуморальный иммунный ответ на определенные антигены (см. гл. 20, п. III.А.1.в).

в. Определение антител к белковым и полисахаридным антигенам. Этот метод основан на определении уровня антител к белковым (например, столбнячному и дифтерийному анатоксинам) и полисахаридным (например, пневмококковой вакцине) антигенам до и после вакцинации. Он применяется лишь в специализированных лабораториях. Нарушение продукции антител к белковым и полисахаридным антигенам подтверждает недостаточность гуморального иммунитета и свидетельствует о необходимости назначения нормального иммуноглобулина для в/в введения (даже при нормальном уровне иммуноглобулинов сыворотки). Определение продукции антител к полисахаридным антигенам у детей младше 2 лет малоинформативно и обычно не проводится (см. гл. 18, пп. IV.А.2.а—б).

2. Исследование функций B-лимфоцитов in vitro. Это исследование оценивает способность B-лимфоцитов к дифференцировке в плазматические клетки и выработке ими иммуноглобулинов в ответ на неспецифический (митоген) и специфический (антиген) стимул в культуре клеток. Его обычно проводят только в научных целях.

Б. T-лимфоциты

1. Исследование функций T-лимфоцитов in vivo

а. Абсолютное число лимфоцитов. Поскольку в норме T-лимфоциты составляют около 70% всех лимфоцитов крови, существенное снижение числа T-лимфоцитов значительно больше сказывается на общем числе лимфоцитов, чем снижение B- или NK-лимфоцитов.

б. Кожные пробы позволяют оценить способность T-лимфоцитов вызывать аллергическую реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48 ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят дерматофитин 0, Трихофитон, антиген вируса эпидемического паротита, очищенный туберкулин, столбнячный и дифтерийный анатоксины (см. гл. 18, п. III.Ж). Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета. Важную роль в диагностике иммунодефицитов играют также данные анамнеза. Так, если в прошлом отмечался аллергический контактный дерматит (например, вызванный ядоносным сумахом), недостаточность клеточного иммунитета маловероятна.

2. Исследование функций T-лимфоцитов in vitro

а. Пролиферативную активность T-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем случае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Интенсивность синтеза ДНК оценивают по включению в нее меченных радиоактивным изотопом нуклеозидов, например 3H-тимидина. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение радиоактивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части T-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 сут. Антиген стимулирует пролиферацию только тех T-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5—7 сут. Для оценки пролиферативной активности T-лимфоцитов, как и при проведении кожных проб, применяют набор широко распространенных антигенов. У ВИЧ-инфицированных пролиферативная реакция T-лимфоцитов на распространенные антигены может быть снижена уже на ранних стадиях заболевания. Прогрессирование ВИЧ-инфекции и других иммунодефицитов сопровождается снижением реакции T-лимфоцитов на аллоантигены, а впоследствии — и на митогены. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.

б. Оценка цитотоксичности. Обычно оценивают цитотоксичность, ограниченную по HLA, опосредованную лимфоцитами CD8 (см. гл. 17, п. II.А.1.а). Клетками-мишенями служат собственные клетки, несущие на своей поверхности чужеродный антиген, связанный с антигенами HLA класса I. Лимфоциты CD8 играют важную роль в защите от вирусных инфекций. Наряду с лимфоцитами CD8 ограниченную по HLA цитотоксичность осуществляют некоторые лимфоциты CD4, распознающие антиген в комплексе с антигенами HLA класса II. Обе субпопуляции лимфоцитов несут антигенраспознающий рецептор, образованный альфа- и бета-цепями. Лимфоциты CD8 с антигенраспознающим рецептором, образованным гамма- и дельта-цепями, участвуют в цитотоксичности, не ограниченной по HLA. Эти лимфоциты присутствуют в крови в незначительном количестве и разрушают клетки-мишени подобно NK-лимфоцитам, то есть без предварительной иммунизации (см. гл. 20, п. III.B). Оценка клеточной цитотоксичности необходима для диагностики иммунодефицитов. Оценку цитотоксической активности лимфоцитов проводят следующим образом: 1) клетки-мишени обрабатывают радиоактивной меткой (51Cr)- 2) к меченым клеткам-мишеням добавляют исследуемые лимфоциты- 3) гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Полученные результаты сравнивают с нормальными показателями. При исследовании ограниченной по HLA цитотоксичности исследуемые T-лимфоциты предварительно инкубируют с антигеном, присутствующим на клетках-мишенях.

в. Исследование цитокинов. Активированные лимфоциты вырабатывают биологически активные вещества — цитокины (см. гл. 1, п. IV.Б). Их уровень определяют с помощью готовых наборов для РИА и твердофазного ИФА. Существуют и более трудоемкие методы исследования цитокинов, основанные на оценке их биологических функций. Оценить содержание цитокинов in vivo довольно сложно, поскольку они прочно связаны с клеточными рецепторами, а в сыворотке и других биологических жидкостях быстро разрушаются.

В. Исследование функций NK-лимфоцитов

1. Цитотоксичность NK-лимфоцитов не зависит от предварительной иммунизации и не ограничена по HLA. Цитотоксическую активность NK-лимфоцитов оценивают с помощью метода, описанного в гл. 20, п. III.Б.2.б, используя в качестве клеток-мишеней разные линии трансформированных клеток, чувствительных к действию NK-лимфоцитов. Разрушение клеток-мишеней осуществляется лишь при образовании тесного контакта с NK-лимфоцитами. Этот контакт может быть прямым или опосредованным, при котором NK-лимфоциты прикрепляются к покрытым IgG клеткам-мишеням через рецептор к Fc-фрагменту IgG — антителозависимая клеточная цитотоксичность. Благодаря этому механизму могут быть разрушены клетки-мишени, первоначально устойчивые к действию NK-лимфоцитов. Антителозависимую клеточную цитотоксичность оценивают с помощью стандартного метода (см. гл. 20, п. III.Б.2.б), используя клетки-мишени, покрытые антителами класса IgG. NK-лимфоциты играют важную роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете и участвуют в отторжении трансплантата. Снижение цитотоксической активности NK-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях, а отсутствие наблюдается крайне редко.

2. Активация NK-лимфоцитов цитокинами. После инкубации с определенными цитокинами цитотоксическая активность NK-лимфоцитов значительно повышается. Так, при добавлении интерферона гамма активность NK-лимфоцитов повышается уже через несколько часов. После инкубации с интерлейкином-2 в течение нескольких суток NK-лимфоциты становятся активными в отношении любых трансформированных клеток-мишеней, в том числе опухолевых клеток. В настоящее время исследуется возможность применения активированных цитокинами NK-лимфоцитов при некоторых злокачественных новообразованиях.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!