Пищевые отравления вызываемые кокковой микрофлорой
К данной группе отравлений относятся заболевания, причиной которых послужили токсины, вырабатываемые стафилококками или стрептококками.ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА. Впервые пищевые отравления, виной которых стали стафилококки, описал П. Н. Лащенков в 1901 году. Им в 1899 году в Харькове изучена вспышка пищевых отравлений после употребления орехового торта с кремом и разработана схема бактериологического и биологического исследования с выделением чистой культуры и контрольных опытах на котятах, щенках, морских свинках и кроликах. Несколько позже (1906 г.), бактериолог Яковлев доказал способность стрептококков вызывать пищевые отравления. В 1909 году Д. Филицин и в 1912 году В. Н. Косарев анализируя вспышки пищевых отравлений на Украине и в Крыму, выдвинули обоснованное предположение о стафилококковой причине некоторых из этих отравлений. За рубежом считается, что первые исследования по изучению этиологической роли стафилококков при отравлениях людей проводились американским бактериологом Барбером (1914 г.). В 1914 году появилось сообщение о коровьем молоке, которое неоднократно вызывало кишечные расстройства у потребителей. Было установлено, что непосредственно после получения молоко было безвредно, но после хранения его в течение нескольких часов в условиях комнатной температуры становилось токсичным. Кокки выделенные из молока, вызывали явления острого отравления при введении вместе с питательной средой, на которой они культивировались. Кокки, вводившиеся без питательной среды через рот щенкам и обезьянам, не давали токсического эффекта.
Это дало основание считать, что желудочно-кишечные расстройства, вызывавшиеся молоком, являются следствием образования в нем токсического вещества в результате жизнедеятельности микроорганизмов после непродолжительного нахождения в условиях комнатной температуры.
Микроорганизмы рода Staphylococcus
Микроорганизмы данного рода представлены примерно 30 видами (из них 14 являются симбионтами - паразитами человека).
Данный микроорганизм был обнаружен в 1878 Р. Кохом. Первых микроорганизмов рода выделил из гноя фурункула в 1880 Л. Пастер, в 1881 г., А. Огстон предложил родовое название Staphylococcus. В 1884 из очагов гнойных поражений человека Ф. Розенбах выделил виды S. albus, S. aureus. Стафилококки являются симбионтами человека и животных, всю жизнь человек проводит в среде контаминированной стафилококками, но они не всегда ограничивают свои взаимоотношения с хозяином рамками безвредного сожительства. По мнению А. К. Акатова и В. С. Зуеваой (1983) наиболее древними видами, являются S.xylosus и особенно S.sciuri. Основанием для подобного предположения служат данные об убиквитарности названных видов, до сих пор сохранивших способность к свободному обитанию в абиотических средах - почвы и воды (Kloos, 1980). Одновременно анализ их биохимической активности свидетельствует в пользу возможности размножения S.sciuri и S.xylosus на неорганическом субстрате. Упомянутые виды также обнаруживаются на наружных покровах практически всех млекопитающих, где из них в процессе адаптации к условиям, имеющим место на коже и слизистых оболочках этих хозяев, вероятно, и генерировали прочие виды стафилококков. Поэтому то в результате подобного эволюционного процесса в настоящее время род Staphylococcus и представлен более чем тридцатью различными видами. Следующим шагом на пути эволюции стафилококков — являлось становление их патогенности, о чём свидетельствует их роль в инфекционной патологии человека и животных (Grosserode, Wenzel, 1991- Roberson et aL, 1994). В определённой степени становление патогенности стафилококков можно оценить как пример "случайного паразитизма", при котором сама патогенность может рассматриваться как функция адаптации микроорганизма к организму хозяина: чем она выше, тем больше вероятность развития инфекции (Домарадский, 1997). По мнению Д.Г. Дерябина все стафилококки по своему месту в биоценозе могут быть разделены на антропофитные и зоофитные виды. Основным хозяином первых являются человек и высшие приматы, а вторых — различные виды птиц и млекопитающих. В частности, для наружных покровов тела человека характерно присутствие S.aureus, S.epidermidis, S.capitis, S.hominis и некоторых других видов стафилококков, относительно редко обнаруживаемых у представителей животного мира (Kloos, 1986). Приматы, наряду с человеком являются хозяевами S.haemolyticus, S.warned, S.simulans, S.cochnii (Schleifer, 1986).
У животных и птиц, т е., среди зоофитных видов стафилококков, так же есть своя «специализация». Так, микроорганизмы вида S.gallinarum преимущественно обнаруживаются у птиц, a S. hyicus, S.chromogenes, S.sciuri, S.lentus, S.vitulus и S.caseolyticus у парнокопытных животных, что объясняет достаточно частое обнаружение этих видов стафилококков в молоке и мясных продуктах (Devriese, 1986). Плотоядные хищники контаминированны стафилококками таких видов, как S.intermedius, S.schleifed и S.fells, при этом первые два — типичные обитатели кожных покровов и слизистых оболочек собак и волков (Hesselbarth et a1, 1994- Igimi et a1, 1990), а последний вид специфичен для кошек (Igimi et а1., 1994).
Но столь жесткая классификация вида микроорганизма по виду хозяина вряд ли стабильна. В таблице 2 приведены суммарные данные по связке микроорганизм – хозяин. В частности, перечисление видов стафилококков, изолированных от коз (Valle et а1., 1991), включал не только такие типичные зоофитные виды, как S. chromogenes (6,6 % от общего количества выделенных культур), S.hyicus (3,8 %) S.sciuri (5,8 %) и S.caprae (5,2 %), но и виды стафилококков, устойчиво обнаруживаемых на коже и слизистых оболочках человека: S.aureus (19,7 %), S.haemolyticus (18,5 %), S.wameri (13,0 %), S.epidermidhs (9,2%). Наиболее частыми изолятами у оленей оказываются S.simulans и S.xylosus, однако достаточно часто среди них встречаются представители антропофитных видов — S.epidermidis, S.hominis, S.capitis (Laukova, 1997). В работе S. Igimi с соавторами (1994), посвященной характеристике стафилококков, изолируемых от кошек, помимо относительно специфичного для данного вида млекопитающих микроорганизма S fells (45 % от общего количества выделенных культур) также идентифицированы S.aureus (13 %), S.intermedius (10 %), S. sciuri (6 %), S.epidermidis (6 %), S.simulans (4 %) и еще шесть менее часто обнаруживаемых видов. Достаточно типичный антропофитный вид S.epidermidis в 13,8 % случаев был также изолирован A. Birgersson с соавторами (1992) с вымени коров, а виды S.h hominis и S.capitis от ослов и прочих сельскохозяйственных животных (С.С. Саторов, М.И. Орзуев, 1987). Выше приведённые данные позволяют утверждать о возможности горизонтального переноса представителей отдельных видов стафилококков между различными макроорганизмами.
Возвращаясь к вопросу о роли стафилококков в патологии человека, следует указать на вид S.aureus, который является лидирующим в инициации широкого спектра заболеваний — от "малых" кожных инфекций, тяжелых септических состояний с возможным летальным исходом до пищевых токсикозов. Существует несколько схем дифференциации среди вида S.aureus Наибольшее распространение в мировой практике нашла схема, предлагаемая V. Hajek и Е. Marsaiek (1976).
Таблица 3.
Частота выделения отдельных видов стафилококков от человека и некоторых сельскохозяйственных и домашних животных
Примечание. 1 - У. К. Нобл, 1986- 2 - С. С. Саторов, М. И. Орзуев, 1987- 3 - J.Valle at al . 1991- 4 - S. Igimi at al. 1994.
Описанные ими биотипы: А, В, С и D используются бактериологами и до настоящего времени. Штаммы биотипа А наиболее часто изолировались от людей- биотипа В — от кур, свиней и кроликов- биотипа С — от коров и овец, биотипа D — от зайцев (Акатов, Зуева, 1983). Биотип Е в дальнейшем был выделен в особый вид — S.intermed (Hajek, 1976), а биотип G и нетипируемые группы UT1 и UT2, чаще всего выделяются от крыс (Kato et al., 1995).
По степени убывания своей этиологической значимости в патологии человека виды стафилококков располагаются последующему вектору S.epidermidis (не менее 50 % от общей численности их клинических выборок) --> S.haemolyticus (< 15 %) --> S.hominis (< 10 %) —> S.simulans (< 8 %) --> S.wameri (< 6 %) --» S.capitis (< 4 %) (Schleifer, 1986 b). Спектр патологически значимых стафилококков может быть расширен за счет новых видов, среди которых следует выделить S.lugdunensis и S.schleiferi (Fleurette et al., 1989). Последний представляет достаточно значимую медицинскую проблему в некоторых европейских странах. Необходимо также указать, что некоторые зоопатогенные виды могут быть этиологически значимы и в патологии человека, как например, при выделении S.caprae при костных инфекциях (Shuttleworth et al., 1997), бактериемии и эндокардите (Vandenesch et al., 1995), S.intermedius — при стафилококковой бактериемии у иммуноскомпрометированных пациентов (Vandenesch et al., 1995 а). Последний вид микроорганизмов фиксировался и как причина гнойного процесса при инфицированных собачьих укусах (Talan et al., 1988).
Общепризнанно, что чем выше становится приспособляемость микроорганизма к существованию во внутренней среде организма хозяина, тем более утрачивается его возможность к развитию в других условиях среды обитания.
МОРФОЛОГИЯ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМА. Эти микроорганизмы в мазках под микроскопом выглядят как шары, образуя скопления напоминающие гроздья винограда (отсюда и название staphylos – гроздь). Спор они не образуют, значит они не обладают высокой устойчивостью к температурному воздействию, однако из безспоровых форм они одни из самых устойчивых бактерий. Жгутиков у них нет, таким образом в их антигенной формуле отсутствует Н-антиген, а присутствует только соматический антиген самой микробной клетки. Грамположительны. Стафилококки неподвижны- факультативные анаэробы- хемоорганотрофы с окислительным и ферментативным метаболизмом, каталаза-положительны- содержат цитохромы, но обычно оксидаза-отрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима (Schleifer, Kloos. 1975). Растут на средах содержащих до15% NaCI, температурный оптимум роста — 35-40°С- предпочтительна слабощелочная реакция среды (7,0-7,5). На плотных средах образуют мутные круглые ровные колонии кремового, желтого или оранжевого цвета. Цвет колоний обусловлен наличием липохромного пигмента, его образование происходит только в присутствии кислорода и наиболее выражено на средах, содержащих кровь, углеводы или молоко. Вызывают характерное разжижение желатина с образованием воронки, заполненной жидкостью (на 4-5 сут.) На жидких средах дают равномерное помутнение, а затем рыхлый осадок, превращающийся в тягучую массу. Восстанавливают нитраты, образуют Н2S, разлагают глюкозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, глицерин, маннит с выделением кислоты- уреаза-положительны- крахмал не гидролизуют- индол не образуют. По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы- среди патогенных видов коагулаза-положителен лишь S. aureus. остальные виды называют коагулаза-отрицательными. Типовой вид — S. aureus.
УСТОЙЧИВОСТЬ. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность- погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 ч. Довольно устойчивы к нагреванию — при 70-80°С погибают за 20-30 мин- сухой жар убивает их за 2 ч. Менее устойчивы к действию дезинфектантов, но резистентны к воздействию чистого этанола. Кокковые микроорганизмы обладают устойчивостью к внешним воздействиям: способны расти при температуре 6,5-46°С, длительно переносят низкие температуры (-20°С), обладают выраженной солеустойчивостью, размножаются в продуктах с содержанием поваренной соли до 15 - 17%, 40% желчи. Они устойчивы и к воздействию кислой среды, сохраняясь в продуктах, где показатель кислотности достигает величины рН = 3,0 (гораздо ниже чем в маринаде), возможен рост в пределах рН 4,2-9,3. Однако нельзя забывать, что сама по себе кокковая микрофлора не вызывает пищевых отравлений. Опасен токсин выделяемый этими микроорганизмами, а его устойчивость значительно превышает устойчивость кокков. Токсин термоустойчив, хорошо сохраняется во внешней среде, устойчив к низким температурам, кислотам. Абсолютный спирт не разрушает его. Токсин полностью не разрушается при нагревании до 100°С в течение 30 минут- он разрушается при кипячении в течение 2 часов, а также автоклавировании при 120°С в течение 30 минут. На размножение кокков и токсинообразование в пищевых продуктах оказывают влияние концентрация соли и сахара. Содержание в продукте до 12% поваренной соли и до 30% сахара не препятствует токсинообразованию. Рост этих микроорганизмов подавляется при концентрации сахара свыше 30% и хлористого натра 20-25%- препятствует накоплению токсина и высокая кислотность продукта.
Дифференцинирование патогенных и непатогенных штаммов. Применяют коагулазный тест на наличие свертывающего фактора, положительный для 95% изолятов, а также определяют способность ферментировать маннит (разлагают)- исследуют способность синтезировать термостабильную ДНКазу и агглютинировать частицы латекса или сенсибилизированные эритроциты барана. Последний тест позволяет выявлять белок А и свертывающий фактор либо оба продукта. Следует помнить о возможных ложноположительных результатах при наличии S. epidermidis и микрококков, а также ложноотрицательных, обычных для метициллин (оксациллин) резистентных штаммов S. aureus (MRSA).
Идентификация штаммов с помощью типовых бактериофагов. Метод типирования патогенных стафилококков бактериофагами достаточно широко применяют в клинической эпидемиологии. Для фаготипирования используют стандартный набор из 20 бактериофагов, разделенных на 4 группы: 1-я группа включает фаги 29, 52, 52А, 79, 80, 2-я — 3А, 3С, 55, 71, 3-я — 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85, 4-я — 42D. С помощью соответствующих бактериофагов удается типировать 60-80% изолятов: установлены особые штаммы (например, фаготипов 80 и 77), наиболее часто выделяемые при вспышках.
АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА. Серологические исследования (например, идентификация) не имеют принципиального значения, а результаты часто носят противоречивый характер. До настоящего времени реагенты для идентификации TSST-1 и AT к нему остаются слабо доступными.
БОЛЕЗНЕТВОРНОСТЬ (ПАТОГЕННОСТЬ). В основе токсикозов, обусловленных кокками, лежит токсическое начало, т.е. принятие с пищей готовых токсинов. Наличие кокков в пищевых продуктах, способность их размножаться, недостаточны для возникновения пищевого отравления, необходимо образование и накопления в них токсина. Токсины способны продуцировать лишь патогенные кокки, которые обладают энтеротоксигенными свойствами.
Будучи грамположительными микроорганизмами, стафилококки не обладают способностью к образованию эндотоксинов, но продуцируют значительное количество экстрацеллюлярных протеиновых факторов с токсическими свойствами — экзотоксинов. Истинные экзотоксины стафилококков не вызывают лизиса клеток, а воздействуют на их метаболизм через локализованные на цитоплазматической мембране специфические рецепторы. При этом все многообразие стафилококковых экзотоксинов может быть объединено в две неравновеликие группы – эксфолиативные токсины, вызывающие спецефическое поражение кожного покрова и энтеротоксины.
Энтеротоксины. Классический взгляд на энтеротоксины обусловлен рассмотрением их в качестве причины тяжелых пищевых отравлений, вызванных поступлением в желудочно-кишечный тракт экзопродуктов стафилококкового происхождения предварительно накопившихся в продуктах питания (Wieneke et al., 1993). Ведущим продуцентом энтеротоксинов являются микроорганизмы вида S.aureus, однако в единичных случаях этиологическая роль в возникновении вспышек пищевых отравлений может принадлежать и токсинпродуцирующим штаммам S.intermedius (Khambaty et al., 1994). При этом основные симптомы данного заболевания — тошнота, рвота, возможно диарея — развиваются у человека при потреблении чрезвычайно малых доз токсина (от 1 мкг).
При схожести клинических проявлений стафилококковых токсикозов, за их возникновение ответственно целое семейство молекул, по своим антигенным свойствам подразделяемых на несколько серологических типов: А, В, С (C l, C 2 и С З — варианты) и D. Относительно недавно были описаны также стафилококковый энтеротоксин Е (Brehm, Tranter, 1993) и энтеротоксин H (Su, Wong, 1995). На обнаружении антигенных различий между энтеротоксинами основаны и традиционные подходы к их выявлению в продуктах питания с использованием иммуноферментных и радиоиммунных методов (Park et al., 1994). В то же время все названные экзотоксины имеют ряд общих характеристик: 1) их молекулы массой от 26 до 34 kDa состоят из одной полипептидной цепи, включающей 239—296 аминокислотных остатков и имеющей одну дисульфидную связь- 2) общим является существование нескольких обусловленных конформационными изменениями изоэлектрических форм каждой из молекул- 3) для них характерна устойчивость к действию высоких температур и протеолитических ферментов, что обусловливает сохранение активности токсинов в продуктах питания при их термообработке, а также в желудочно-кишечном тракте (Marrack, Kappler, 1990).
Действие стафилококковых энтеротоксинов при пероральном введении аналогично действию энтеротоксинов, образуемых микроорганизмами иных таксономических групп, т е нарушается выход из клеток-мишеней воды и ионов хлора и поступление внутрь них ионов калия.
Накопившиеся к началу 80-х годов данные о летальных случаях септицемии, раневых, и других инфекций стафилококковой этиологии, многие из которых протекали с синдромом выраженной интоксикации по-иному заставили взглянуть на механизм действия энтеротоксинов и их патогенетическое значение при стафилококковых инфекциях. Клинические же проявления интоксикации не были связаны рвотой или диареей, но заключались в резком повышении температуры, нарушении функции печени и почек, понижении артериального давления и в ряде случаев — необратимом падении сердечной деятельности. В эти же годы сходное заболевание - синдром токсического шока (СТШ) описано у женщин в период менструального цикла (Ратгауз, Акатов, 1986), когда из влагалищного отделяемого были изолированы культур S.aureus, продуцирующие ранее неизвестный токсин — TSST, по своей молекулярной организации, сходный с прочими стафилококковыми энтеротоксинами (Kum et a1, 1993).
Изучение механизмов развития синдромов токсического шока позволило выявить у стафилококковых энтеротоксинов и TSST способность к связыванию с главным комплексом гистосовместимости на поверхности антигенпрезентирующих клеток, что в дальнейшем ведет к поликлональной стимуляции Т-лимфоцитов (Marack, Kapk 1990), а также вызывает индукцию выброса иммунокомпетентными клетками широкого спектра цитокинов (Kum et al., 1993). При этом было продемонстрировано, что активация Т-лимфоцитов совместно с цитокиновым "взрывом" и развитие шока являют патогенетически зависимыми феноменами (Bonventre et a 1993).
Таким образом, в соответствии с современными представлениями, у большинства стафилококковых экзотоксинов (СЕ, СЕВ, СЕС, TSST и др.) могут быть продемонстрированы два принципиально различных свойства: 1) энтеротоксичность - проявляющаяся в развитии рвоты и диареи при пероральном введении нескольких миллиграмов этих протеинов- 2) способность при попадании в кровеносное русле в дозе от 1 пкг/мл до 1 мкг/мл индуцировать Т-клеточную активацию и выработку ряда цитокинов (Yokomizo et al., 1995). Последнее свойство - активации Т-клеточного звена иммунитета, дало данному феномену название "суперантигенной" стимуляции. Соответственно, сами стафилококковые экзотоксины, способные качественно изменять иммунные реакции организма хозяина, были оценены как семейство структурно и функционально близких белков — суперантигенов (Johnson et al, 1991).
Открытие суперантигенов, обнаруженных помимо стафилококков у стрептококков явилось одним из наиболее ярких событий в микробиологии конца XX века, значительно изменивших представления о патогенезе заболеваний инфекционной природы.
Оптимальными условиями образования в мясе, фарше и печени токсина стафилококков, является хранение продуктов при температуре 28-37°С и рН среды 6,6-7,2- при температуре ниже 20°С и рН среды 6,5-6,0 образование токсина замедляется, а при температуре ниже 15°С и рН среды 6,0-4,5 прекращается. Установлено, что при одинаковых условиях хранения кокки и токсин накапливаются в вареном мясе и печени в 2-3 раза, а в вареном фарше в 5-7 раз быстрее, чем в цельных кусках сырого мыса и печени. Быстрота выработки токсина и его активность не всегда параллельны скорости размножения микробов. Стафилококк хорошо развивается, продуцируя токсин, на самых различных пищевых продуктах. Содержание в продукте до 12% поваренной соли и до 50% сахара не препятствует размножению стафилококков и токсинообразованию. Образование токсина происходит лучше при пониженном парциальном давлении кислорода. В лабораторных условиях для получения токсина культуру выращивают в эксикаторе при 20% СО2. Размножение стафилококков и токсинообразование могут быть и в анаэробных условиях, в частности в консервах (В.И. Тец 1958).
Развитие стафилококка на пищевых продуктах и накопление здесь энтеротоксина не вызывает заметного изменения органолептических свойств этих продуктов.
Количество токсина, способное вызвать интоксикацию, накапливается в мясном фарше, содержащем 50% белого хлеба, при комнатной температуре через 4-5 часов, а в готовых котлетах - через 3 часа. Добавление белого хлеба к фаршу в качестве наполнителя значительно ускоряет образование токсина. Пример 50% штаммов золотистого стафилококка (чаще всего фагогруппы 111) продуцируют токсины вызывающие гастроэнтерит с тяжёлой рвотой и профузным поносом. Более половины этиологически расшифрованных пищевых отравлений в развитых странах мира связаны со стафилоккоком.
Пожалуй, ни один из видов бактерий не может конкурировать со стафилококком по числу факторов патогенности. Факторами патогенности стафилококков, помимо токсинов, являются так же: микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты.
Микрокапсула защищает бактерии от комплемент-опосредованного поглощения полиморфноядерными фагоцитами, способствует адгезии микроорганизмов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro обычно не образуется.
Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций: усиливают синтез интерлейкина макрофагами, активируют систему комплемента. Тейхоевые кислоты облегчают адгезию к эпителиальным поверхностям. Белок А (агглютиноген А) активирует компоненты комплемента. Активация комплемента приводит к проявлению различных местных и системных реакции, например анафилаксии, феномена Артюса, угнетению активности фагоцитов и т.д.
Ферменты проявляют разнонаправленное действие: каталаза защищает бактерии от действия механизмов фагоцитоза- b-лактамаза разрушает молекулы b-лактамовых антибиотиков- липазы облегчают адгезию и проникновение в ткани. Коагулаза, существующая в 3 антигенных формах, вызывает свертывание сыворотки- сам фермент не взаимодействует с фибриногеном, а образует тромбиноподобное вещество, предположительно взаимодействующее с протромбином.
Гемолизины. Золотистые стафилококки способны одновременно синтезировать несколько подобных продуктов, в частности выделяют 4 антигенных типа гемолизинов (a-Гемолизин (a-токсин), b-Гемолизин (сфингомиелиназа), g-Гемолизин, d-Гемолизин, вызывающие полный гемолиз кровяных сред- кожные некротические реакции и гибель животных после внутривенного введения ( Классификация факторов патогенности дана в редакции В.И. Покровского, О.К. Поздеева 1998)
