Методы выявления и исследования простейших
Видео: ГЕМОСКАНИРОВАНИЕ Исследование живой капли крови
ПироплазмидыДля выявления пироплазмид исследуют мазки крови от животных, больных или подозреваемых в заболевании. В случае гибели или вынужденного убоя больных животных мазки можно готовить из содержимого сосудов мозга, селезенки, печени, почек, легких и пораженных лимфатических узлов. Мазки готовят только из органов свежих трупов, так как в них паразиты быстро лизируются, особенно при высокой температуре окружающей среды. В необходимых случаях принимают меры для исключения инфекционных болезней.
Используют хорошо обезжиренные стекла. Кровь для исследования лучше всего брать из периферических сосудов ушной раковины. Место взятия подготавливают путем выстригания волосяного покрова, затем проводят дезинфекцию и обезжиривание этиловым спиртом, спиртом-эфиром. Инъекцию проводят иглой или подрезают ножницами кончик уха.
Каплю крови в диаметре не более 2-3 мм, выступающую на месте прокола, наносят на край обезжиренного предметного стекла и делают мазок. Очень важно мазок подготовить с первой капли крови, т.к. в ней значительно больше пораженных пироплазмидами эритроцитов. Следующий мазок необходимо готовить из свежей капли крови после удаления сгустка с места инъекции.
Изготовление мазков необходимо проводить в период повышения температуры тела животных и появления первых клинических признаков, до введения специфических препаратов. Мазки просушивают на воздухе 10-20 мин, избегая воздействия прямых солнечных лучей и ограничивая доступ мух. Затем их подписывают иглой или простым карандашом, указывая вид и номер животного, дату и место взятия.
Для фиксации используют метиловый спирт, которым заливают мазки крови на 3-5 мин, после этого стекла вынимают и высушивают 15-20 мин.
Можно фиксировать смесью равных частей абсолютного этилового спирта и эфира или только этиловым спиртом 15-20 мин.
Хорошо подготовленный мазок должен быть равномерным и тонким. В толстых мазках эритроциты и находящиеся в них паразиты обнаруживаются с большим трудом.
Окраску можно производить по Романовскому-Гимзе. Для приготовления рабочего раствора краски на 1 мл дистиллированной воды добавляют 1-3 капли основного раствора краски. Рабочий раствор лучше всего подслаивать под стекло с мазком. В этих случаях на мазке не остается микрочастиц нерастворившейся краски, что облегчает при микроскопии поиск кольцевидных форм пироплазмид и дифференциальную диагностику. Длительность прокрашивания мазков составляет 30-40 мин. По истечении этого срока краску смывают, мазок промывают дистиллированной водой, высушивают и исследуют с использованием микроскопа. Качество окраски зависит от рН среды (оптимальной средой является 6,8-7,0). Правильно окрашенные мазки имеют розовый цвет с фиолетовым оттенком. Эритроциты окрашиваются в розовый цвет, протоплазма лимфоцитов – в синий, их ядра – в темно-фиолетовый, протоплазма паразитов – в голубой, кусочки хроматина – в темно-красный или красный цвет.
Исследуют мазки под микроскопом с иммерсионной системой.
Диагностика эймериозов и изоспорозов
Для выявления наличия ооцист эймерий и изоспор из фекалий, содержимого кишечника и другого материала используется несколько методов.
Метод нативного мазка наиболее простой и легко выполнимый в любых условиях, не требующий специальной аппаратуры и реактивов для обнаружения ооцист.
На чистое предметное стекло пипеткой наносят 2-4 капли чистой воды (дистиллированной, водопроводной), к ним добавляют небольшое количество фекалий и перемешивают. Мазок накрывают покровным стеклом и исследуют под малым (х 8,10) и средним (х 40) объективом . Вместо фекалий можно исследовать таким же образом соскобы оболочек кишечника.
При небольшой степени заражения ооцист выявить таким методом трудно, однако при высоком заражении он дает возможность сравнительно достоверно определить интенсивность инвазии.
Более точные результаты получают при использовании различных растворов, имеющих большой удельный вес. В таких растворах ооцисты через некоторое время всплывают на поверхность.
Наиболее распространенными флотационными методами являются следующие: методы Фюллеборна, Дарлинга, Щербовича, Котельникова и Хренова и др. (см. Гельминтоовоскопия).
Исследование эймериид в пораженных органах. Для исследования на наличие эймериид у животных отбирают кусочки тонкого и толстого кишечника, у кроликов, кроме того, печень, у гусей также почки. Материал помещают в фиксирующую жидкость – 10%-ный раствор формалина или 96%-ный этиловый спирт. Лучше всего использовать нейтральный формалин, для приготовления которого используют порошок углекислого кальция (мел), 10% его добавляют к объему формалина и дают отстояться 5-6 дней, затем хранят с осадком.
Фиксацию материала лучше производить в стеклянной посуде. В зимнее время в качестве фиксирующей жидкости лучше использовать этиловый спирт. Ее, независимо от времени года, рекомендуется через сутки заменять. Если в одну банку помещают кусочки органов от разных животных, их рекомендуется завернуть в марлевые мешочки. Внутрь банки с фиксирующим материалом помещают бумажную этикетку, на которой графитным карандашом указывают вид животного, его номер и дату взятия материала.
Приготовленные гистологические срезы лучше всего окрашивать гематоксилин-эозином.
При необходимости сохранения ооцист эймериид на длительное время используют 5%-ный раствор формалина, 0,1%-ный раствор калия двухромовокислого, жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина на изотоническом растворе натрия хлорида).
Токсоплазмы
Для выделения токсоплазм используют органы павших животных: головной мозг, лимфатические узлы, печень, селезенку, легкие, плаценту и органы абортированного плода. Вначале готовят мазки-отпечатки из пораженных органов, которые фиксируют метиловым спиртом (этиловым) и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Отбор органов и приготовление мазков производят не позже 2-3 часов после убоя или падежа животных. Указанным способом выделить токсоплазм удается не всегда.
Более эффективным способом является постановка биопробы на белых мышах.
Для этого отобранный материал из внутренних органов растирают с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида и полученную суспензию вводят 3-5 белым мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл. В положительных случаях на 5-7 день развивается болезнь, при которой в брюшной полости накапливается экссудат, содержащий большое количество токсоплазм. При отрицательной биопробе, а также для накопления токсоплазм можно проводить 3-5 «слепых пассажей» путем введения суспензии головного мозга мышам от зараженных ранее белых мышей новой партии мышам.
Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на токсоплазмоз животных, утвержденными 21.01.84, рекомендуется для обогащения материала цистами применять метод искусственного переваривания в желудочном соке. Патматериал (лимфоузлы, продолговатый мозг абортированного плода) измельчают, 50 г фарша помещают в колбу емкостью 1 литр и заливают 10 объемами искусственного желудочного сока. Колбу помещают в термостат при температуре 37°С на 1,5 часа. Полученную массу фильтруют через марлю, затем фильтрат центрифугируют при 2 тыс. об./мин. в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспензируют в двойном объеме изотонического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин по 1 тыс. ЕД на 1 л суспензии). Суспензию в дозе 0,3 мл вводят внутрибрюшинно 3-5 белым мышам.
Для обнаружения токсоплазм готовят мазки из содержимого брюшной полости или мазки-отпечатки из головного мозга, фиксируют, затем окрашивают по Романовскому-Гимзе.
Наличие возбудителя в организме животных может быть подтверждено путем использования РСК (РДСК), которую ставят в соответствии с «Временным наставлением по применению токсоплазмозного антигена Каз.НИВИ и института зоологии АН Каз.ССР в реакции связывания комплемента РСК (РДСК) для серологической диагностики токсоплазмоза и токсоплазмоносительства у животных».
Саркоцисты
Для обнаружения саркоцист исследуют у овец шейную часть пищевода, скелетные мышцы. Находят макроцисты величиной с просяное зерно и больше.
У свиней их можно обнаружить в мышцах диафрагмы, межреберных и др. Саркоцисты освобождают от окружающей ткани, на предметном стекле разрушают в 2-3 каплях изотонического раствора натрия хлорида, затем каплю суспензии микроскопируют при среднем увеличении микроскопа с опущенным конденсором. В положительных случаях обнаруживают банановидные (серповидные) мерозоиты.
Обнаружение микроцист производят путем исследования срезов величиной с овсяное зерно с мышц пищевода, диафрагмы, сердца, скелета. Срезы исследуют в раздавленном в компрессории виде под малым увеличением микроскопа. Их можно окрашивать по Романовскому-Гимзе, генцианвиолетом, метиленовой синью и др.
Саркоцист можно также обнаружить и при гистологическом исследовании пораженных тканей. Отобранные кусочки ткани фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина. Гистосрезы готовят общепринятыми методами, а окрашивают гематоксилин-эозином.
Трихомонады
Выделение трихомонад производят путем микроскопического и культурального исследования патологического материала (истечения и смывы из половых органов, околоплодная жидкость, соскобы с плаценты, содержимое сычуга абортированного плода, секрет придаточных половых желез, спермы).
Для обнаружения подвижных трихомонад наносят на предметное стекло патологический материал в виде толстого мазка или делают раздавленную каплю и микроскопируют вначале под малым, затем средним увеличением микроскопа при затененном поле зрения микроскопа. Мазок можно окрашивать по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией в метиловом спирте.
Посевы исследуемого материала производят на специальные питательные среды (среда Петровского) в количестве 0,3-0,5 мл из осадка пробы. Материал помещают в термостат при 370С и исследуют на 3, 5, 7 и 10 день. Уже через 24-46 часов может наблюдаться рост трихомонад.
Вышеуказанные методы используются для выделения трихомонад при поражении половых органов у крупного рогатого скота.
У свиней, птиц трихомонады обитают в кишечнике и некоторых других органах. Для выделения паразитов используют соскобы с пораженных органов и исследуют нативным мазком.
Имеются данные о том, что и эти трихомонады хорошо растут на искусственных питательных средах.
Балантидии
Выделение балантидий производят путем исследования свежевыделенных фекалий или взятых из прямой кишки животного. Материал необходимо подвергнуть исследованию не позднее 2-3 часов после его взятия. Трупы свиней на наличие балантидий исследуют в течение 5-6 часов после смерти животного. В более поздние сроки балантидий обнаружить не удается в связи с их лизисом. По некоторым данным (А.И.Федоров, 1980) трупы следует подвергать исследованию на обнаружение балантидий в течение 1,5-2 часов после убоя или гибели поросят.
Микроскопическое исследование фекалий лучше всего провести непосредственно на ферме, используя метод нативного мазка. Для этого берут небольшое количество фекалий, помещают на предметное стекло и равномерно перемешивают с равным количеством теплого изотонического раствора натрия хлорида или дистиллированной воды (температура не более 37,0°С), накрывают покровным стеклом и просматривают мазок под малым увеличением микроскопа. В положительных случаях обнаруживают вегетативные формы и цисты балантидий. Под микроскопом отчетливо видны крупные, быстро передвигающиеся при помощи ресничек паразиты.
При необходимости гистологического исследования отбирают кусочки стенок толстого и тонкого кишечника, желудка, лимфоузлов, паренхиматозных органов и фиксируют в 10% растворе формалина. Гистосрезы окрашивают гематоксилин-эозином.
Поделиться в соцсетях:
Похожие
