Лабораторная диагностика
«Золотым стандартом» является выделение возбудителя. Следует помнить, что материал необходимо исследовать быстро, т.к. бактерии склонны к быстрому аутолизу, обусловленному активностью внутриклеточных ферментов. Материалом для исследования является мокрота, плевральный выпот и прочие экссудаты, спинномозговая жидкость, кровь, слизь из носа и зева, отделяемое глазных изъязвлений, выделения из уха, моча, кусочки органов (в случае смерти больного). Сигнальный ответ на пневмококковую инфекцию может быть выдан при обнаружении в мазках из мокроты нейтрофилов и грамположительных ланцетовидных диплококков (не менее 10 в поле зрения). В противном случае прибегают к выделению возбудителя.Первый этап исследования. Патологический материал подвергают предварительной бактериоскопии (кроме крови). Мокроту помещают в стерильную чашку Петри, отмывают, петлей захватывают гнойно-слизистый комочек, растирают на предметном стекле, высушивают и красят по Граму. В мазке обнаруживают грамположительные ланцетовидной или овальной формы кокки, окруженные капсулой (капсулообразование наблюдается только у пневмококков, выделенных от больных и зараженных животных). Выявление капсул пневмококков можно проводить по методу Бурри-Гинса. Посев патологического материала производят на 5-10% кровяной или сывороточный агар и на среду обогащения (8-10% сывороточный бульон). При подозрении на сепсис пневмококковой природы 5-10 мл крови больного засевают на 45-90 мл сывороточного бульона. Спинно-мозговую жидкость, если она прозрачна, центрифугируют и несколько капель из осадка засевают на питательные среды. В качестве среды обогащения используют полужидкий сывороточный агар. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Лучшим методом выделения чистой культуры пневмококков является заражение белых мышей патологическим материалом. Мокроту, отмытую в чашке Петри стерильным физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке стерильным пестиком или битым стеклом при добавлении физиологического раствора в отношении 1:2-1:5. Взвесь отстаивают, надосадочную жидкость в количестве 0,5-1 мл вводят белым мышам внутрибрюшинно. При наличии в материале пневмококков мыши погибают в течение 72 часов. В мазках из органов и крови обнаруживают типичные пневмококки. Также производят посев органов и крови на сывороточный бульон и на чашки Петри с кровяным или сывороточным агаром.
Второй этап исследования. Изучают характер роста на питательных средах. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, круглые, с ровными
краями, нежные, окруженные зоной позеленения среды (что весьма напоминает рост зеленящих стрептококков). На сывороточном агаре колонии нежные, полупрозрачные и прозрачные. При бактериоскопии мазков, окрашенных по Граму. обнаруживают грамположительные диплококки без капсул. После бактериоскопии колонии, подозрительные на пневмококки пересеивают на скошенный сывороточный или кровяной агар или на сывороточный бульон. При микроскопии мазков со среды обогащения наряду с различной микрофлорой можно обнаружить грамположительные кокки, располагающиеся парами или короткими цепочками. Материал со среды обогащения пересеивают на плотные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа.
Третий этап исследования. Па скошенном кровяном агаре пневмококки образуют нежный тонкий полупрозрачный налёт. На сывороточном бульоне пневмококки вызывают помутнение и легкий осадок. В мазках с плотных питательных сред пневмококки могут иметь различный вид. Наряду с диплококками удлиненной формы с заостренными наружными концами, напоминающими пламя свечи, встречают клетки правильной овальной и круглой формы. В бульонной культуре пневмококки часто располагаются цепочками. Па основании морфологических и культуральных свойств пневмококки трудно отличить от зеленящих стрептококков, поэтому для их дифференцировки предложен набор специальных тестов:
•растворимость в желчи (дезоксихолатная проба)-
•способность разлагать инулин-
•чувствительность к оптохину-
•реакция агглютинации со специфическими антипневмококковыми сыворотками-
•способность разлагать глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит и салицин.
Наиболее доступными методами, дифференцирующими пневмококки от прочих стрептококков являются проба с оптохином (угнетает их рост)- от зеленящих стрептококков их отличает способность ферментировать инулин, а также чувствительность к желчи.
Дезоксихолатная проба. После предварительной бактериоскопии в пробирку с 5 каплями стерильной бычьей желчи вносят 10 капель, выделенной чистой культуры (лучше бульонной). Контролем служит культура, внесённая в пробирку с 5 каплями физиологического раствора. Через 30-60 минут инкубации при 37 °С наблюдают полный лизис культуры в виде просветления в пробирке с желчью, в контрольной пробирке смесь остаётся мутной. Следует помнить, что авирулентные культуры пневмококка устойчивы к желчи.
Устойчивость к желчи также можно проверять посевом в 10% желчный бульон. В среду вносят исследуемый материал, при этом бульон мутнеет. После 24 часовой инкубации при 37 °С на наличие пневмококков укажет просветление бульона в результате лизиса бактерий.
Также можно использовать диски, пропитанные 20% раствором желчи. Диски помешают на выросшую культуру в чашке и инкубируют 1-2 часа при 37 °С. При наличии пневмококков колонии лизируются вокруг диска на расстоянии 1 -2 мм.
Проба на инулин. Культуру пневмококка засевают на среду с инулином. Для этого к 100 мл прогретой при 56 °С в течение 30 мин бычьей сыворотки прибавляют 200 мл стерильной дистиллированной воды, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина, стерилизуют текучим паром 30 минут. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Пневмококк разлагает инулин, в результате чего среда краснеет. Зеленящий стрептококк не вызывает покраснения среды.
Проба с оптохином. Испытуемую культуру пневмококка засевают на сывороточный бульон с оптохином в разведении 1:100000 или 1:200000. Пневмококк на такой среде не растёт. Также можно определить чувствительность к оптохину и посевом на 10% кровяной агар, содержащий оптохин в разведении 1:50000. Контролем является посев культуры на кровяной агар. Пневмококки не растут на среде с оптохином, на контрольной среде наблюдается рост пневмококков. Можно использовать диски, пропитанные 6 мкг оптохина, которые накладывают после посева на поверхность среды. У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 18 мм диаметром.
Проба на вирулентность. Суточную культуру пневмококка, выращенную на сывороточном бульоне разводят 1% стерильной пептонной водой (рН - 7,6) или слабощелочным бульоном до 1:10. Разведённую культуру вводят внутрибрюшинно белым мышам весом 16-20 гр в объёме 0,5 мл и наблюдают в течение 72 часов. Из органов погибшей мыши делают высевы на питательные среды и микроскопируют мазки-отпечатки.К высоковирулентным культурам относят пневмококки, вызывающие гибель мышей после введения культуры в разведении 1:10. Авирулентные культуры не вызывают гибели мышей.
Серотипирование пневмококков. 18-часовую культуру проверяют в реакции микроагглютинации по Сэбину. На предметное стекло наносят 4 капли культуры пневмококка. К 1 капле добавляют каплю антипневмококковой сыворотки типа 1, ко 2-й — сыворотку типа II, к 3-й — сыворотку - 111, к 4-й — каплю нормальной сыворотки. Смеси на стекле перемешивают петлей и рассматривают под лупой или под микроскопом при малом увеличении. В положительном случае в одной из первых трех капель наблюдается агглютинация. Тип пневмококка определяют в реакции агглютинации со специфическими агглютинирующими сыворотками первых трёх фиксированных типов. Культуры, которые не агглютинируются указанными типами сывороток, относят к Х-группе. Реакцию ставят следующим образом. Разливают 18 - часовую бульонную культуру по 0,5 мл в пробирки. Затем вносят в равном объёме сыворотки, разведённые физиологическим раствором в соотношении 1:5. Контролями служат 2 пробирки, одна из которых содержит испытуемую культуру в смеси с
нормальной кроличьей сывороткой, а другая — только исследуемую культуру. Содержимое пробирок тщательно встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 °С, после чего проводят предварительный учет реакции. Окончательные результаты отмечают после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 20 часов. Агглютинацию оценивают на четыре плюса, если содержимое пробирок полностью просветляется, а агглютинационная культура представляет собой плотную пленку, не разбивающуюся при встряхивании- на три плюса если при полном просветлении содержимого пробирки агглютинирующая культура легко разбивается на части- на два плюса — если просветления не наступает, в мутном содержимом пробирки хорошо видны невооруженным глазом частицы агглютинированной культуры- при агглютинации на один плюс в пробирке обнаруживают мелкозернистую смесь склеенных пневмококков. При отрицательной реакции, видимой глазом, агглютинации не наблюдают-
содержимое пробирок после встряхивания представляет собой равномерную муть.
Типирование пневмококков Х-группы проводят с помощью групповых сывороток, содержащих смесь типовых агглютинирующих сывороток, взятых в равных объёмах. Готовят следующие групповые сыворотки путем смешивания равных объемов неразведенных типовых диагностических сывороток (Lund, I960):
А -1, II, IV, V, XVIII серовары-
В - VI, VIII, XIX серовары-
С - VII, XX. XXIV, XXXI, XL серовары-
D - IX, XI, XVI, XXXVI. XXXVII серовары-
Е - X, XXI. XXXIII, XXXIX серовары-
F - XII. XVII. XXII, XXXVII, XXXII, XLI серовары-
G - XIII, XXV. XXIX, XXXIV, XXXV, XXXVIII, XLII, XLVII серовары-
J - XLIII. XLIV, XLV, XLVI серовары.
Агглютинирующую сыворотку III типа используют per se (без смешивания с другими типовыми сыворотками) из-за трудности ее получения в достаточно высоком титре. Типирование проводят в два приёма: сначала с помощью групповых сывороток, а затем с индивидуальными сыворотками той группы, с которой была получена положительная реакция. Серотипирование пневмококков применяют преимущественно для эпидемиологических исследований результатов специфической серотерапии и серопрофилактики.
Микроагглютинацию пневмококков по методу Сэбина можно получить при смешивании антипневмококковых сывороток с экссудатом из брюшной полости мыши, зараженной мокротой больного. Уже через четыре часа после заражения в экссудате обнаруживают чистую культуру пневмококков, дающую положительную агглютинацию по Сэбину.
Ускоренные методы обнаружения и типирования пневмококков. 1. Метод Нойфельда или феномен набухания капсулы пневмококка. По одному комочку свежевыделенной мокроты больного наносят на три
покровных стекла, к каждому из них прибавляют каплю неразведенной специфической антипневмококковой сыворотки (1, II, III типов) и каплю синьки Лёффлера. Капли тщательно смешивают, покрывают предметным стеклом с лункой, смазанной по краям вазелином. Через две минуты рассматривают висячие капли под микроскопом с иммерсионной системой. При положительном случае видно резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заветны. Реакция набухания специфична и не даёт положительного результата с другими капсульными бактериями. Её не применяю г для исследования мокроты от больных, леченных сульфаниламидами и антибиотиками, т.к. в этом случае могут выделяться безкапсульные пневмококки.
2. Метод преципитации. 5-10 мл мокроты кипятят в водяной бане до получения плотного сгустка. Сгусток растирают и добавляют небольшое количество физиологического раствора, вновь кипятят несколько минут для извлечения специфического полисахарида из пневмококков. Взвесь центрифугируют, с полученной прозрачной жидкостью и специфическими типовыми сыворотками в преципитационных пробирках ставят реакцию кольцепреципитации. Появление кольца на границе соприкосновения жидкостей указывает на положительный результат.
3. Определение капсул пневмококков по Бурри. На конец предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и каплю туши. Смесь перемешивают и делают мазок, высушивают на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют. Фон препарата — тёмно-дымчатый, микробные тела и их капсулы не окрашиваются. Препарат, изготовленный по Бурри, можно зафиксировать смесью Никифорова, промыть водой, окрасить фуксином Циля, разведенным 1:3 в течение 3-5 минут. На тёмном фоне мазка выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко малинового цвета (метод Гинса).
Мотивирующая характеристика темы: пневмококк один из основных возбудителей бактериальных пневмоний. В случае генерализации инфекции микроорганизм может гематогенно диссеминировать во внутренние органы и вызвать менингиты, эндокардиты, отиты, суставные поражения и т. д. Знание правилдиагностики и лечениязаболеваний, вызванных этими микроорганизмами, необходимо для студентов всех факультетов.
Студент должен знать: правила забора материала при инфекциях, вызванных данными микроорганизмами, препараты для лечения и профилактики заболеваний.
Студент должен уметь:
- окрашивать препараты по Граму, Бурри-Гинсу и простым методом (фуксином)-
- дифференцировать микробы по морфологическим признакам при микроскопии-
- проводить выделение чистой культуры микроорганизма и идентифицировать его по морфологическим, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам.
Студент должен иметь навыки:
- соблюдения правил противоэпидемиологического режима и техники безопасности в бактериологической лаборатории-
- обеззараживания инфицированного материала, антисептической обработки рук, контаминированных исследуемым материалом, культурами микроорганизмов-
- стерилизации петли прокаливанием-
- приготовления микроскопических препаратов из чистых культур микробов-
- микроскопии с иммерсионной системой-
- посева исследуемого материала петлей, шпателем на плотные и жидкие питательные среды-
- выдачи результатов исследования-
- чтения и оценки результатов микробиологических исследований. Оснащение занятий:
1. Таблицы по лабораторной диагностике пневмококковой инфекции.
2. Бланки направления на анализ.
3. Препараты для лечения пневмококковой инфекции: пенициллин, левомицетин, рифампицин, винкомицин, цефтриксон.
4. Предметные стекла для приготовления мазков и набор красок для окраски по Граму и Бурри-Гинсу. Учебная карта занятия-
1. Изучить схему лабораторной диагностики пневмококковой инфекции по таблице.
2. Изучить под микроскопом микропрепараты пневмококков, окрашенные по Граму и методу Бурри-Гинсу.
3. Научиться писать направление на исследование материала от больного.
4. Заполнить бланк выдачи ответа.
5. Разобрать диагностические и лечебные препараты, применяемые при пневмококковой инфекции.
6. Изучить состав и правила применения пневмококковой вакцины. Вопросы для самоподготовки и самоконтроля:
1. Какова морфология пневмококков?
2. Каковы их культуральные и биохимические свойства?
3. Как можно создать капнофильные условия культивирования пневмококков?
4. Какой материал берется при подозрении на заболевания, вызванные пневмококками?
5. Как проводится бактериоскопическое исследование и какие методы окраски используют при подозрении на пневмококковую инфекцию?
6. Как проводят бактериологическое исследование?
7. Как ставится реакция "набухания капсулы"?
5. Как проводится бактериоскопическое исследование и какие методы окраски используют при подозрении на пневмококковую инфекцию?
6. Как проводят бактериологическое исследование?
7. Как ставится реакция "набухания капсулы"?
8. Какие препараты используются для лечения и профилактики пневмококковой инфекции?
Поделиться в соцсетях:
Похожие
