Материалы и методы исследований

Видео: Лекция 2.5 | Методы исследования наноструктур. Виды и принципы работы устройств исследования

Отбор проб проводят из трахеи, легких, воздухоносных мешков, экссудата, костного мозга, подглазничных синусов, содержимое кишечника и клоаки, из печени, головного мозга, селезенки, крови (рисунок 15). От больных и трупов павших утят, кроме этого, берут соскобы со слизистой оболочки носа, гортани и подглазничных синусов. Материал для последующих исследовании хранят в охлажденном, лучше замороженном виде. Для выделение вируса ГП используют 9-11 – дневные куриные эмбрионы, которые заражают в аллантоисную или амниотическую полость. Все штаммы вируса А1 (классической чумы птиц) вызывает гибель эмбрионов через 25-36 часов после заражения, с возрастанием вирулентности возбудителя по мере увеличения количества пассажей, до 107-108 ЭЛД 50/мл.

После выделения проводят серологическую идентификацию вируса, определяя специфическую антигенные способности штамма в РЗГА, РН в эмбрионах кур, ИФА, реакция торможения нейраминидазой активности (РТНА), реакция радиального гемолиза, в РДП (определяя сходство гемагглютинина и нейраминидазы), в полимеразой цепной реакции (ПЦР) – для определения генома вируса, выявленные вирусной нуклеиновой кислоты в пробах патологического материала и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также для дифференциации антигенных подтипов вируса. Биопроба проводиться внутривенным заражением цыплят аллантоисной жидкостью эмбрионов кур, инфицированных выделением изолятом вируса ГП. Если из 10 цыплят в течение 10 дней гибнет 6 голов, то выделенный вирус ГП считается высокопатогенным.

Рисунок 15 - Отбор проб материалов (сердце, селезенка)



Схема лабораторной диагностики птичьего гриппа показана на рисунке 16. Применяемые в настоящее время методы лабораторной диагностики гриппа птиц можно разделить на четыре группы:

Серологические реакции

- Реакция гемагглютинации (РГА)

- Реакция тормажения гемгглютинации (РТГА)

- Иммуноферментный анализ (ИФА)

- Реакция нейраминидазы (РИНА)

- Реакция нейтрализации (РН)

Выделение вируса

- Реакция на куриных эмбрионах

- Культура клеток MDCK, Vero

Молекулярно-генетические исследования

- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

- Реал-тайм ПЦР

- Расшифровка генома вируса

Электронно-микроскопическиеисследования

- Изучение морфологии вируа

- Электронно-микроскопическое фотографирование РГА

Для идентикации вируса в патологическом материале можно использовать РГА. Надосадочную жидкость после центрифугирования суспензии проб из органов и тканей больной птиц, а также смывов исследуют в капельной или пробирочной РГА с 1% суспензии эритроцитов кур или 0,5% взвесью эритроцитов морской свинки. Реакцию учитывают через 20 минут и 1 час. Специфичность определяют в РТГА [35].

Идентификацию испытуемого вируса проводят с набором эталонных штаммоспецифицеских гриппозных сывороток к его нтигенным вариантам. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса БН. РТГА ставят микро- или макрометодом по общепринятой методике [36].

Рисунок 16 - Лабораторная диагностика птичьего гриппа



Диагностика гриппа комплексная с обязательным выделением, идентификацией вируса и постановкой биопробы. Для ретроспективной серологической диагностики используют РЗГА. Для серологических исследований используют РДП, РНГА, МФА, РСК, а также метод иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенный для экспресс титрования антител к вирусу ГП по гемагглютинину и нейраминидазе.

При проведении иммуноферментного анализа (ИФА) используют оборудование, показанное на рисунке 17. На рисунке 18 показаны схемы профедения ИФА.

Видео: Учебные материалы

Рисунок 17 - Оборудование для проведения ИФА

Видео: Современные методы исследования гортани у взрослых и детей

Рисунок 18 – Схемы метода ИФАСхема метода ИФА двойных антител

«сэндвича» для определения антигена Схема «непрямого» метода ИФА для

определения антител

В полимеразой цепной реакции (ПЦР) – определяют геном вируса, выявленные вирусной нуклеиновой кислоты в пробах патологического материала и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также для дифференциации антигенных подтипов вируса. При постановке реакции используют следующие оборудование (рисунок 19):

Рисунок 19 - Оборудование для ПЦР<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!