Пассивный транспорт воды

Не существует молекулярных механизмов активного транспорта воды, подобных мембранному белку, активно транспортирующему Na+, например Na+,К+-АТФаза. Вода может перемещаться либо по градиенту гидростатического, либо по градиенту осмотического давления, и поскольку гидростатический градиент через эпителий кишечника равен нулю, то основным механизмом транспорта воды является осмотический градиент.

Термин "осмотическое давление" был долгое время не очень понятным для студентов и практических врачей как минимум по двум причинам. Во-первых, он означает, что существует еще какое-то давление, помимо гидростатического. На самом деле "осмотическое давление" является неправильным термином, который появился только из-за того, что градиент растворенных веществ повышает гидростатическое давление в осмометре. Лучшим названием было бы "осмотический потенциал".

Осмотическое давление л, обычно выражается как

л = RTCs,

где: Cs — общая концентрация растворенных веществ в осмолях/кг Н2О. Разница в осмотических давлениях через кишечный эпителий выражается как /л, то есть

/л = RT/Cs.



Здесь мы видим вторую причину неясности термина "осмотическое давление". ?? является пассивной силой, возникающей из-за разницы в концентрации воды, но для удобства выражается в виде разницы в концентрации солей. Поэтому необходимо понимать, что градиент растворенных веществ определяет градиент концентрации воды- оба этих градиента определяют реальную направленность движения воды из зоны ее высокой концентрации в зоны с высокой концентрацией растворенных веществ.

Еще одно важное обстоятельство заключается в том, что общий осмотический эффект растворенных веществ более выражен, если это растворенное вещество находится в каком-то ограниченном объеме. Например, при непереносимости лактозы неабсорбированная глюкоза не может покинуть просвет кишечника и создает выраженный осмотический эффект, вызывая осмотическую диарею. Понятие осмотической диареи основано на том факте, что причиной секреции воды в некоторых случаях является неабсорбируемый осмотический эквивалент. Необходимо также помнить, что все перемещения воды происходят посредством осмотических механизмов, хотя причины осмотических нарушений (как и при секреторной диарее) не всегда понятны.



Слизистая оболочка тонкой кишки легко проницаема для воды

Перемещение больших объемов воды через стенку кишечника предполагает, что эпителий кишечника легко для нее проницаем, поскольку через малопроницаемый барьер даже при высоком осмотическом градиенте перемещения молекул воды не происходит. Принципы, по которым действуют механизмы транспорта воды через мембраны, аналогичны закону Ома для электричества: поток воды пропорционален осмотическому давлению и степени проницаемости мембраны для воды.

Подобно другим веществам, проникающим через кишечный эпителий, вода проходит либо трансцеллюлярно, либо через межклеточные соединения и пространства. Молекулярные механизмы этих путей транспорта воды недостаточно хорошо изучены, однако знание действия подобных механизмов в других органах, например в почках, позволяет проводить определенные аналогии. Исследование простого липидного бислоя, являющегося нормальным структурным компонентом мембраны многих клеток, показало, что он достаточно хорошо проницаем для воды. Поэтому некоторое время считали, что транспорт воды происходит через липидный слой клетки. Однако в последнее время получены данные о существовании в клеточной мембране особого класса белков, служащих каналами для проведения воды. Возможно эти белки, или что-то похожее на них, могут отвечать за проницаемость энтероцитов для воды. Еще меньше изучены механизмы межклеточного транспорта воды, хотя известно, что часть воды проходит именно этим путем (рис. 5-5).

Рис. 5-5.

Трансцеллюлярный и интерцеллюлярный пути транспорта воды

Транспорт солей определяет транспорт воды

Еще в ранних работах по исследованию транспорта веществ в кишечнике показано, что в норме абсорбция воды и электролитов происходит таким образом, что, несмотря на большие объемы перемещения электролитов и воды, содержимое кишечника остается изотоничным плазме крови. Эти данные не позволили прежним исследователям объяснить, как происходит всасывание воды, если нет градиента осмотического давления, поэтому казалось, что существует механизм активного транспорта воды в кишечнике. Позже было показано, что всасывание воды происходит исключительно пассивно посредством осмотического градиента, возникающего вследствие всасывания электролитов, и что оба этих процесса тесно связаны. Отсутствие реальной разницы осмотических давлений в стенке кишечника является следствием действия двух факторов. Первый — высокая проницаемость стенки кишечника для воды предполагает настолько маленький трансэпителиальный осмотический градиент (??), необходимый для всасывания воды, что его трудно определить экспериментально. Второй, по-видимому, связан с тем, что в межклеточных латеральных пространствах происходит кумуляция солей, что создает местный локальный градиент, способствующий перемещению жидкости. Главный принцип остается прежним — всасывание воды происходит пассивно вследствие транспорта солей, преимущественно NaCl. Это является ключом к пониманию того, что именно нарушение транспорта солей — основная причина многих видов диареи.

Секреция жидкости в кишечнике также регулируется секрецией солей клетками, расположенными в криптах. Термин "секреторная диарея" является следствием того факта, что бактериальные токсины и другие агенты могут вызывать повышенную стимуляцию секреции солей в просвет кишечника с соответствующим объемом секреции воды. Причина этого — нарушение молекулярных механизмов контроля, которые в норме регулируют кишечную секрецию.



Поверхностные клетки и клетки крипт специализированы для абсорбции и секреции

Абсорбция и секреция солей, приводящие к перемещению воды через стенку тонкой кишки, осуществляются специализированными клетками эпителия. Абсорбция осуществляется эпителиальными клетками ворсинок, которые активно абсорбируют Na+. Секреция производится клетками, расположенными в криптах, которые активно перемещают Cl–. Несмотря на то, что эти клетки активно транспортируют столь разные ионы, параллельно осуществляется и котранспорт: абсорбция Na+ не может происходить без абсорбции Cl–, а секреция Cl– происходит с параллельным перемещением Na+. Активный транспорт является основой перемещения ионов, а перемещение ионов с противоположным зарядом — также неотъемлемая часть этого процесса.

На Рис. 5-6 показаны молекулярные механизмы транспорта солей клетками ворсинок и крипт в тонкой кишке. В обоих типах клеток вектор транспорта ионов связан с выраженным полярным распределением мембранных белков, которые способствуют транспорту ионов через апикальные и базолатеральные участки мембраны клеток. В настоящее время найдены и специальные гены, ответственные за синтез этих белков.

Особой структурой как в абсорбирующих, так и в секретирующих клетках является Na+,K+-ATФaзa. Этот транспортный белок расположен исключительно на базолатеральных участках мембраны клеток кишечника и связывает непосредственно процессы ионного транспорта и энергетические процессы в клетках. Na+,K+-АТФаза поддерживает низкий уровень внутриклеточного Na+ и высокую концентрацию внутриклеточного К+ за счет гидролиза АТФ. Na+,K+-ATФaзa создает градиенты концентраций Na+ и K+, необходимые для поддержания абсорбционной и секреторной активности в эпителиальных клетках кишечника.



Абсорбирующие клетки

Мембрана щеточной каемки абсорбирующих клеток специализирована в отношении пассивного транспорта Na+ в клетки из просвета кишки. В тонкой кишке это происходит преимущественно двумя путями. Первый путь: антипорт Na+/H+, специализирующийся на катализе обмена этих ионов в соотношении 1:1. При этом ионы натрия входят в клетку, а протоны водорода выходят из клетки. Второй механизм — котранспортер Na+/глюкоза, переносящий внутрь клетки ионы Na+ и молекулы глюкозы в соотношении 1:1, либо в соотношении 2:1. Таким образом, в присутствии глюкозы Na+ поступает в клетку вместе с ней. В этом механизме свободная энергия натриевого градиента способствует абсорбции глюкозы. Однако необходимо отметить, что наличие глюкозы в просвете кишки резко повышает абсорб

Рис. 5-6.

Молекулярные механизмы транспорта веществ клетками ворсинок и крипт в тонкой кишке

. Показаны некоторые мембранные белки, участвующие в транспорте солей через апикальные и базолатеральные участки мембраны. Разница электрических потенциалов (Vm) между апикальными и базолатеральными участками мембран абсорбирующих и секретирующих клеток ориентирована таким образом, что клетки относительно экстрацеллюлярной жидкости имеют отрицательный заряд. Величина Vm на базолатеральном участке мембраны больше, чем Vm апикального участка мембраны, поэтому трансэпителиальный электропотснциал, измеренный через слой эпителиальных клеток, является отрицательным со стороны просвета кишки



цию натрия, усиливая его проникновение в клетки. Этот механизм лежит в основе использования растворов глюкозы перорально для регидратации больных с диареей, так как глюкоза повышает абсорбцию Na+ и воды. Растворы, содержащие только необходимые электролиты, менее эффективны, поскольку они не стимулируют глюкозозависимый транспорт Na+ в клетки.

Na+,K+-ATФaзa базолатерального участка мембраны и белки-переносчики Na+ в апикальных отделах мембраны клеток отвечают за трансцеллюлярный перенос Na+ из просвета кишки в кровь- поэтому активный транспорт Na+ — основной механизм абсорбции солей и воды. Абсорбция Сl–, соответствующая абсорбции натрия, происходит двумя путями. Часть Сl– абсорбируется из межклеточного пространства благодаря слабому электрическому потенциалу, отрицательному со стороны просвета кишки. Кроме этого, существует и трансцеллюлярный механизм абсорбции Сl–, обеспечиваемый Сl–/НСО3–-антипортом в апикальном участке мембраны. Механизм транспорта хлора через базолатеральный участок мембраны пока не совсем понятен: это может быть либо Сl–-селективный канал, либо Сl–,K+-котранспортер. Образование Н+ и НСО3– из угольной кислоты с помощью карбоангидразы способствует сочетанному транспорту Na+ и Сl–.



Секреторные клетки

Транспортные белки в секреторных клетках отличаются от транспортных белков в клетках ворсинок (рис. 5-6). Содержание Na+ в клетках регулируется белками базолатерального участка мембраны, в то время как проницаемость для Na+ в апикальных отделах клеток относительно мала. Натрий поступает в клетку через базолатеральный участок мембраны посредством механизма сочетанного транспорта- в каждом цикле в клетку переносится по одному иону Na+ и К+ и по два иона Cl–. Так как суммарный заряд при таком переносе ионов равен нулю, скорость транспорта зависит не от мембранного потенциала, а от концентрации этих трех ионов. Суммарный эффект направленных внутрь градиентов Na+ и Cl– и направленного наружу градиента 1C приводит к перемещению всех трех ионов внутрь клетки. Натрий, который входит в клетку и выходит из нее, рециркулирует за счет Nа+,К+-АТФазы. Таким образом, поддерживается высокий градиент Na+ вне клетки. Транспортный белок в этих клетках сходен с белком апикальной мембраны клеток почечных канальцев, переносящих натрий. Фармакологический эффект некоторых диуретиков (фуросемида, буметанида) основан на их влиянии именно на этот белок.

Ионы хлора, которые проникают в клетку через базолатеральные участки мембраны, выходят из клетки через селективные Cl–-каналы в апикальных участках мембраны. Хлор выходит из клетки пассивно. Концентрация Cl– в клетке постоянна и составляет около 30 ммоль/л, в просвете кишки она в три раза меньше, при этом разность потенциалов — около 50-60 мВ. Поэтому при открытии каналов Cl– выходит из клетки (рис. 5-6). Выход Na+ требуемый для компенсации выхода Cl–, происходит преимущественно интерцеллюлярно под действием отрицательного электрического потенциала в просвете кишки. Надо сказать, что активная абсорбция Na+ и активная секреция Cl–, несмотря на разнонаправленный транспорт, создают отрицательный потенциал в просвете кишки (см. подпись к Рис. 5-6). Интересно отметить, что основные механизмы этой секреции встречаются у некоторых позвоночных, но не у млекопитающих, например у акул и птиц, которые имеют так называемые "солевые железы", секретирующие соль.



Цитоплазматическая цАМФ является основным регулятором абсорбции и секреции

Секреция и абсорбция солей — регулируемые процессы, и их нарушение приводит к диарее. Цитоплазматическая циклическая АМФ (цАМФ) является основным фактором в их регуляции. Механизмы, приводящие к повышению концентрации цАМФ в цитоплазме, как правило, усиливают секрецию и снижают абсорбцию солей, приводя к суммарному увеличению секреции. Для понимания этих процессов необходимо описать регулируемые транспортные механизмы (каналы и транспортеры) и компоненты клеточных систем, связанные с цАМФ.

На Рис. 5-7 представлен вторичный мессенджер сигнальной системы (цАМФ), характерный для большинства клеток. Некоторые агонисты, стимулы и фармакологические препараты активируют эту систему, влияя на синтез цАМФ, разрушение цАМФ или на оба этих процесса. Активирующий стимул может взаимодействовать с регуляторным G-белком либо прямо, либо через рецепторы, повышая активность аденилатциклазы, что приводит к увеличению синтеза цАМФ из АТФ. Молекула цАМФ связывается в цитоплазме с регуляторными субъединицами другого фермента (протеинкиназы А), вызывая отщепление активной каталитической субъединицы, которая может катализировать перенос фосфата на клеточные белки.

Наиболее важным механизмом в регуляции внутриклеточных процессов является фосфорилирование, которое имеет значение для транспорта электролитов и воды в кишечнике, в частности в секреторных клетках кишечных крипт. Как показано на Рис. 5-6, любое трансцеллюлярное перемещение Cl– (как поступление хлора через базолатеральные, так и выход хлора через апикальные участки мембраны) регулируется реакцией фосфорилирования. Фосфорилирование апикального Сl–-селективного канала увеличивает время открытия этого канала, а фосфорилирование Na+,K+, 2Cl–-тpaнcпopтнoгo белка усиливает активность этого процесса. Таким образом, любой стимул, увеличивающий содержание в клетке цАМФ, может вызвать резкое усиление активной секреции Cl–.

Роль цАМФ в механизме абсорбции до конца не изучена, хотя есть убедительные данные, говорящие за то, что повышение концентрации цитоплазматической цАМФ уменьшает абсорбцию солей, вероятно, угнетая абсорбцию Na+ и Cl– на апикальном участке мембраны. Суммарный секреторный эффект при повышении концентрации цАМФ усиливается, поскольку, с одной стороны, происходит увеличение секреции, с другой — уменьшение абсорбции. Нет данных о влиянии цАМФ на активность котранспортера Na+ и глюкозы апикального участка мембраны. Поэтому такой путь поступления Na+ в клетку не подавляется даже в случае сильной стимуляции, приводящей к значительному повышению секреции Cl–. Это объясняет эффективность регидратации пероральным приемом растворов глюкозы при лечении диареи.

Циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) также является важным мессенджером в регуляции секреции Cl–. Он образуется под действием гуанилатциклазы и активирует киназу, известную как протеинкиназа G. Циклический ГМФ, как и цАМФ, усиливает секрецию солей, а также ослабляет абсорбцию, хотя тонкие молекулярные основы этих изменений еще менее изучены. Следующим внутриклеточным мессенджером является кальций, который также модулирует абсорбцию и секрецию, хотя механизмы этого действия тоже пока мало изучены.



Cl–-канал апикального участка мембраны является трансмембранным регулятором, "сопровождающим" муковисцидоз

В последние годы резко возрос интерес к белку, функционирующему в качестве хлорного канала в апикальных участках мембраны секреторных клеток тонкой кишки, поскольку при врожденном заболевании — муковисцидозе (кистозном фиброзе) обнаружена мутация гена, кодирующего именно этот белок. Ген кодирует белок , состоящий из 1480 аминокислот и названный муковисцидозным трансмембранным регулятором (cystyc fibrosis transmembrane conductance regulator [CFTR]), который действует в качестве Cl–селективного ионного канала. Он активируется цАМФ и имеется в клетках поджелудочной железы, кишечника, дыхательных путей, половых органов. Мутация этого гена приводит к нарушению секреции Cl–, что является причиной многих симптомов при муковисцидозе. Нарушение транспорта Cl– может быть прямым следствием дисфункции CFTR Cl–канала. Мутация может приводить: (1) к образованию неполной цепочки белка, который быстро разрушается в клетке, (2) к синтезу белка с нормальной длиной цепочки, но не встраивающегося в апикальный участок мембраны, (3) к синтезу белка с полной (нормальной) длиной цепочки, но функционально дефектного, который встраивается в апикальный участок мембраны. Наиболее частая мутация — это потеря фенилаланина в положении 508 (ДР508), приводящая к образованию цепочки белка с почти полной длиной, не встраивающейся в мембрану клетки.

Молекулярные механизмы активации CFTR были изучены при анализе его аминокислотного состава (см. Рис. 5-8). Большой цитоплазматический домен (R-домен) содержит много участков, подвергающихся фосфорилированию проте

Рис. 5-7.

Схема действия вторичного мессенджера сигнальной системы (цАМФ), обнаруженного в большинстве клеток

. Связывание гормона (или нейротрансмиттера) с его рецептором образует активированный комплекс, взаимодействующий со стимулирующим G-белком (G-)

Рис. 5-7 (

продолжение

). Активированный G-белок освобождается от гуанозиндифосфата (ГДФ), с которым он связан в неактивированном состоянии, и соединяется с гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Это приводит к образованию С-д и Gp у-субъединиц, после чего Gsa связывается с аденилатциклазой, которая катализирует образование цАМФ из АТФ. Циклическая АМФ образует связи с регуляторными субъединицами протеинкиназы А, от которой отсоединяются каталитические субъединицы, регулирующие фосфорилирование соответствующих участков белков. (По: DarnellJ., Lodish H., Baltimore D. Molecular Cell Biology, 2nd ed. New York Scientific American Books, W. H. Freeman, 1990.)

Рис. 5-8.

Вероятное строение CFTR. Белок состоит из 1480 аминокислот, образующих около пяти доменов

: два мембранно-соединенных домена (MSD1 и MSD2), каждый из которых содержит шесть сегментов, организованных таким образом, что формируют хлорный канал- и три цитоплазматических домена (NBF-1, NBF-2 и R), регулирующих активность канала



инкиназой А (ПКА). Было установлено, что удаление этих участков снижает активность хлорных каналов при повышении концентрации цитоплазматической цАМФ. Эти каналы имеют также два других цитоплазматических регуляторных домена, которые называются нуклеотидсвязывающими, так как они почти гомологичны семейству белков, связывающих и гидролизующих АТФ. Повышение концентрации цАМФ в цитоплазме активирует CFTR следующим образом: цАМФ связывается с каталитической субъединицей протеинкиназы А и освобождает активную каталитическую субъединицу, которая способствует фосфорилированию одной или нескольких сериновых структур R-домена CFTR. Затем нуклеотидсвязывающие участки присоединяют и гидролизуют АТФ, что в результате открывает каналы. Затраты энергии при этом необходимы для изменения конформационной структуры канала, что ведет к его открытию, после чего происходит пассивный транспорт ионов и затрат АТФ для этого процесса не требуется.

В секреторных клетках кишечника CFTR является единственным хлорным каналом, в то время как в секреторных клетках других тканей (дыхательные пути и слюнные железы) имеется еще и кальцийзависимый Сl–канал в апикальном участке мембраны. Поэтому у больных с муковисцидозом эпителий кишечника не способен секретировать Сl–. Исследования распределения матричной РНК, проведенные с помощью гибридизации клеток показали, что информация для синтеза CFTR реализуется в клетках крипт кишки, где и происходят секреторные процессы.



Энтеротоксины бактерий активируют систему вторичных мессенджеров в клетках

Большинство данных о внутриклеточных механизмах абсорбции и секреции получены при изучении эффектов бактериальных энтеротоксинов, вызывающих тяжелую диарею. Наиболее показательно исследование холерного экзотоксина Vibrio cholerae — инфекции, вызывающей эпидемии в Азии и Южной Америке. Кишечная секреция под действием холерного токсина является следствием длительной активации аденилатциклазы и увеличения концентрации цитоплазматической цАМФ. Экзотоксин представляет собой пептид с массой 84 кД и состоит из одной А и пяти В субъединиц. Субъединица А является простым полипептидом массой 29 кД, в свою очередь, она состоит из двух компонентов — Al (23 кД) и А2 (6 кД), соединенных дисульфидным мостиком. После связывания холерного токсина через свои В субъединицы с поверхностью апикальной мембраны субъединица А проникает в клетку, где высвобождается компонент Al. В цитоплазме он действует как белок, катализирующий ковалентную модификацию G-протеина для активации аденилатциклазы. АДФ-рибоза присоединяется к аргининовому остатку ?-субъединицы Gs, после чего модифицированная ?-субъединица отсоединяется от ?- и ?-субъединиц и активирует аденилатциклазу, что приводит к повышению цАМФ и стимуляции апикальных Cl–-каналов в секреторных клетках и к снижению активности абсорбирующих клеток. В конечном счете это завершается тяжелой секреторной потерей солей и воды, опасной для жизни. Предполагается, что наличие у больного мутации гена CFTR, вызывающей у гомозигот тяжелые проявления муковисцидоза, у гетерозигот (с потерей только одного гена) сопровождается меньшей чувствительностью к некоторым факторам, способствующим секреторной диарее. Естественными стимуляторами секреции, опосредованными цАМФ, являются секреторные нейротрансмиттеры и, прежде всего, вазоактивный интестинальный полипептид.

Другим важным способом оценки механизмов нарушения секреторного процесса явилось исследование действия термостабильного энтеротоксина Escherichia coli (группа из 18-19-аминокислотных пептидов), активирующего гуанилатциклазу щеточной каемки. Эти секретируемые пептиды связываются с рецепторами гормона гуанидина на апикальном участке мембраны. По-видимому, данные рецепторы сами являются гуанилатциклазой, а связывание с ними стимулирует секрецию и угнетает абсорбцию через механизм цитоплазматической цГМФ.<< ПредыдушаяСледующая >>
Внимание, только СЕГОДНЯ!